Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging
Summary
Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.
Abstract
Nella corteccia visiva primaria di non-mammiferi roditori, i neuroni sono raggruppati in base alla loro preferenza per le funzioni di stimolo come l'orientamento 1-4, direzione 5-7, dominanza oculare 8,9 e disparità binoculare 9. Selettività Orientamento è la caratteristica più studiati ed una mappa continua con un quasi-periodico disposizione per l'orientamento preferito è presente su tutta la corteccia visiva primaria 10,11. L'integrazione dei contributi sinaptiche, cellulare e di rete che portano a risposte di stimolo selettivo in queste mappe funzionali richiede l'ibridazione di tecniche di imaging che si estendono su sub-micron di millimetro scale spaziali. Con l'imaging convenzionale segnale ottico intrinseco, il layout generale di mappe funzionali tutta la superficie della corteccia visiva può essere determinato 12. Lo sviluppo in vivo di due fotoni microscopia utilizzando coloranti sensibili calcio permette di determinare la SYNAPTingresso ic arrivare a spine dendritiche singoli 13 o record di attività contemporaneamente da centinaia di singoli corpi cellulari neuronali 6,14. Di conseguenza, combinando l'imaging intrinseca segnale con la sub-micron risoluzione spaziale di due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare esattamente quali segmenti dendritiche e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale nella neocorteccia. Qui mostriamo un alto rendimento metodo per ottenere rapidamente una mappa corticale orientamento e di una versione specifica micro-dominio in questa mappa funzionale per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in un non-roditore mammifero. Con il microscopio stesso utilizzato per l'imaging a due fotoni, dobbiamo prima di generare una mappa di orientamento utilizzando l'imaging intrinseca segnale ottico. Poi ci mostrano come assegnare un micro-dominio di interesse con una micropipetta caricato con colorante per l'etichetta sia una popolazione di corpi cellulari neuronali o l'etichetta di un singolo neurone in modo tale che dendriti e degli assoni, le spine sono visibili invivo. Nostri perfezionamenti rispetto ai metodi precedenti facilitare un esame della neuronali relazioni struttura-funzione con sub-cellulare risoluzione nel quadro neocorticali architetture funzionali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo un metodo per indirizzare l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali (o dendriti e degli assoni) in pre-determinati funzionali micro-domini della neocorteccia. Fusione di imaging intrinseca segnale ottico con due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare quali sinapsi e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale, sia correlato selettività neuronali con la posizione del neurone in una mappa funzionale, e il circuito neuronale componenti che cambiano con l'esp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e finanziamento da parte delle Fondazioni Dana & Whitehall a PK Ringraziamo Matteo Petrella per l'assistenza alle procedure chirurgiche, Grazia Dion a rintracciare i dendriti illustrato nella figura 5a e Pratik Chhatbar per commenti sul manoscritto.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
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