특정 기능 내장 신호를 결합하여 네크로의 마이크로 도메인과 투 광자 영상에서 뉴런의 대상 라벨링
Summary
방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.
Abstract
비 쥐 포유류의 주요 시각 피질에서 뉴런은 같은 방향 1-4, 방향 5-7, 안구 지배력 8,9와 쌍안경 격차 구 등의 자극 기능에 대한 자신의 선호에 따라 클러스터됩니다. 오리엔테이션 선택성이 가장 널리 연구 기능 및 원하는 방향의 준주기적인 레이아웃과 지속적인지도 전체 기본 시각 피질 10,11에 걸쳐 존재합니다. 이 기능지도에 자극 선택적 응답을 초래할, 신경 세포 및 네트워크 기여를 통합하면 mm 공간적 스케일로 하위 미크론에 걸쳐 이미징 기술의 하이브리드가 필요합니다. 기존의 고유 신호를 광 이미징을 통해 시각 피질의 전체 표면에 걸쳐 기능지도의 전체적인 레이아웃은 12 결정될 수있다. 칼슘 민감한 염료를 사용하여 생체 내 두 광자 현미경의 개발은 synapt을 결정하는 하나를 수IC의 입력은 개별 neuronal 세포 기관 6,14 수백에서 동시에 각각의 수지상의 쪽에서 13 또는 기록 활동을 도착. 따라서, 두 광자 현미경의 하위 마이크론 공간 해상도로 고유 신호 영상을 결합하는 것은 수지상 세그먼트 및 세포 네크로의 모든 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 정확히 결정의 가능성을 제공합니다. 여기 빠르게 대뇌 피질의 방향지도를 취득하고 비 쥐 포유류에 형광 염료와 뉴런을 라벨이 기능지도의 특정 마이크로 도메인을 타겟팅 할 수있는 높은 수율 방법을 보여줍니다. 두 광자 이미징에 사용 된 것과 같은 현미경으로, 우리는 먼저 고유 신호 광학 이미징을 사용하여 오리엔테이션지도를 생성합니다. 그럼 우리가 어느 라벨을 염료로로드 micropipette를 사용하여 관심있는 마이크로 도메인을 타겟팅하는 방법을 보여 neuronal 세포 기관 또는 라벨 수석, 쪽과 axons은에서 볼 수있는 그러한 하나의 뉴런을의 인구생체. 앞의 방법을 넘어 개선이 neocortical 기능 아키텍처의 프레임 워크의 하위 세포 해상도 neuronal 구조 – 기능 관계의 시험을 용이하게합니다.
Protocol
1. 외과 준비 마취를 유도하고 지속적으로 심장 박동을 모니터링 갯벌 CO 2, EEG, 온도를 모두 종료합니다. 모든 절차는 사우스 캐롤라이나의 의과 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 우리는 이전에 9,15을 발표 이들에 기초했다. 메스 블레이드로 피부를 절단하여 두개골의 등 표면을 쉽게받을 수 있습니다. Brudon의 퀴렛를 사용하여 뼈를 놓?…
Representative Results
우리 염료 라벨 방법의 정밀도를 설명하기 위해, 우리는 비 쥐 네크로에 알려진 기능지도의 가장 작은 마이크로 도메인을 대상으로. 띄엄 띄엄 이론은 기본 영상 피질의 방향지도를 통해 끝까지. 이들은 모두 원하는 방향 이러한 수렴 지점에서 발생하는 선호하는 취향, "풍차"(그림 2A-B)와 같은 특이한 모양 주변 지역의 위색지도 인치 craniotomy 당 하나의 바람개비는 특히 15<…
Discussion
우리는 네크로의 미리 정해진 기능 마이크로 도메인에 neuronal 세포 기관 (또는 수석과 axons)의 라벨을 타겟팅하는 방법을 제시한다. 두 광자 현미경과 고유 신호 광학 이미징을 병합하는 시냅스와 세포가 어떤 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 결정의 가능성을 제공 여부 기능지도에서 뉴런의 위치, 그리고 neuronal 회로와 neuronal 선택성의 상호 구성 요소를 시각적 경험 7 임상 치료 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그림 5A에 표시된 수석을 추적하는 그레이스 디온;이 작품은 또한, 우리는 수술 절차에 도움을 마 Petrella 감사 국립 안과 연구소 R01EY017925과 R21EY020985과 데이 & 화이트 홀 재단에서 PK까지 자금의 보조금에 의해 지원되었으며, Pratik Chhatbar에 대한 원고에 대한 의견.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
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Cite This Article
O’Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).