استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون
Summary
يوصف أسلوب لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في المجالات المحددة سلفا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. أولا، يتم استخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية للحصول على خريطة وظيفية. ثم يتم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتسمية الخلايا العصبية والصورة ضمن مجال الصغيرة من على الخريطة.
Abstract
في القشرة البصرية الأولية غير القوارض الثدييات، وتتجمع الخلايا العصبية وفقا لتفضيلهم لميزات مثل التحفيز التوجه 1-4، الاتجاه 5-7 و هيمنة العين والتفاوت مجهر 8،9 9. الانتقائية التوجه هو السمة الأكثر دراسة على نطاق واسع وخريطة المستمر مع تخطيط شبه دورية لتوجيه المفضل موجود في القشرة البصرية الأولية 10،11 كامل. دمج مساهمات متشابك، وشبكة الخلوية التي تؤدي إلى تحفيز استجابات انتقائية في هذه الخرائط وظيفية يتطلب التهجين من تقنيات التصوير التي تمتد الفرعية ميكرون إلى المقاييس المكانية ملليمتر. مع الإشارة التقليدية التصوير الضوئي الجوهرية، يمكن تحديد تخطيط الشامل للخرائط وظيفية عبر كامل سطح القشرة البصرية 12. تطوير مجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة تمكن واحد لتحديد synaptجيم إدخال تصل إلى العمود الفقري شجيري الفردية 13 أو سجل نشاط في وقت واحد من مئات الأفراد أجسام الخلايا العصبية 6،14. وبناء على ذلك، والجمع بين التصوير الجوهرية إشارة للقرار الفرعية ميكرون المكاني للثنائي الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد بالضبط التي شرائح والخلايا الجذعية تسهم إلى المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية في القشرة المخية الحديثة. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة ذات الإنتاجية العالية للحصول على الخارطة بسرعة التوجه القشرية واستهداف محدد الصغيرة النطاق في هذه الخريطة الوظيفية لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في الثدييات غير القوارض. مع المجهر نفسها التي استخدمت لمدة الفوتون التصوير، ونحن أولا توليد خريطة التوجه باستخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية. ثم نعرض كيفية استهداف الدقيقة مجال الاهتمام باستخدام micropipette محملة صبغة إما تسمية عدد سكانها أجسام الخلايا العصبية أو العصبونات تسمية واحدة بحيث التشعبات، والعمود الفقري محاور عصبية واضحة فيالجسم الحي. لدينا أكثر من التحسينات الطرق السابقة تسهيل دراسة العلاقات هيكل الوظائف العصبية مع شبه الخلوية القرار في إطار البنى الوظيفية القشرة المخية الحديثة.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم طريقة لاستهداف بوضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية (أو محورا وتشعبات عصبية) في المجالات المحددة مسبقا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. دمج الجوهرية التصوير الإشارات الضوئية مع اثنين من الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد أي نقاط الاشتباك العصبي وال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون R01EY017925 وR21EY020985 والتمويل من المؤسسات دانا وايت هول لPK كما نشكر متى بتريا للحصول على المساعدة مع العمليات الجراحية؛ غريس ديون لتعقب التشعبات هو مبين في الشكل 5A، وبراتيك Chhatbar لل تعليقات على المخطوط.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
