Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem
Summary
É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.
Abstract
No córtex visual primário de mamíferos não roedora, os neurônios são agrupados de acordo com sua preferência por características de estímulo, tais como orientação 1-4, direção de dominância, 5-7 ocular 8,9 e 9 disparidade binocular. Seletividade orientação é a característica mais amplamente estudada e um mapa contínuo com um layout quase-periódica para orientação preferencial está presente em toda a córtex visual primário 10,11. Integrando as contribuições sinápticas, celular e rede que levam a respostas de estímulo seletivos nestes mapas funcionais requer a hibridização de técnicas de imagem que abrangem sub-mícron de milímetro escalas espaciais. Com imagem do sinal óptico intrínseco convencional, o layout geral dos mapas funcionais por toda a superfície do córtex visual pode ser determinado 12. O desenvolvimento de microscopia in vivo de dois fotões usando corantes de cálcio sensíveis permite que se determine a SYNAPTentrada IC chegar espinhas dendríticas individuais 13 ou registro de atividade simultaneamente a partir de centenas de corpos individuais de células neuronais 6,14. Consequentemente, a combinação de imagem do sinal intrínseco, com a resolução espacial sub-micron de dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar exactamente quais os segmentos dendríticas e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional no neocórtex. Aqui demonstramos um método de alto rendimento para a rápida obtenção de um mapa de orientação cortical e visando um domínio específico de micro-neste mapa funcional para rotular neurônios com corantes fluorescentes em um mamífero não roedora. Com o mesmo microscópio usado para dois fótons de imagem, primeiro gerar um mapa de orientação usando imagens de sinal óptico intrínseco. Então, vamos mostrar como alvo um domínio de micro-de interesse usando uma micropipeta carregado com corante para qualquer rótulo de uma população de corpos celulares neuronais ou etiqueta de um único neurônio de tal forma que os dendritos e axônios, espinhas são visíveis novivo. Nossos refinamentos mais métodos anteriores facilitar um exame da neuronais relações estrutura-função com sub-celular resolução no âmbito da neocorticais arquitecturas funcionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos um método para alvejar a rotulagem de corpos celulares neuronais (ou dendritos e axônios) na pré-determinados funcionais micro-domínios do neocórtex. A fusão de imagem do sinal óptico intrínseco com dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar quais as sinapses e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional, quer correlaciona selectividade neuronal com a localização do neurónio em um mapa funcional e o circuito neuronal componentes que a mudança com uma …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e financiamento das Fundações Dana & Whitehall para PK Agradecemos também Mateus Petrella para a assistência com procedimentos cirúrgicos; Graça Dion para rastrear os dendritos mostrados na Figura 5A e Pratik Chhatbar para comentários sobre o manuscrito.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
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