特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識
Summary
方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。
Abstract
非げっ歯類哺乳動物の一次視覚野では、ニューロンはそのような方向性1-4、方向5-7、眼優位8,9と両眼視差9として刺激特徴のための彼らの好みに応じてクラスタ化されます。方位選択性は最も広く研究されている機能であり、好ましい向きの準周期的なレイアウトの連続写像全体の一次視覚野10,11越えて存在している。これらの機能マップの刺激選択的応答につながるシナプス、細胞、ネットワークの貢献を統合することにより、ミリメートルの空間スケールにサブミクロンをまたぐイメージング技術のハイブリダイゼーションを必要とします。従来の内因性シグナル光学イメージングでは、視覚皮質の表面全体機能マップの全体的なレイアウトは、12を決定することができます。カルシウム感受性色素を用いたin vivoでの 2光子顕微鏡の開発は、SYNAPTを決定するために、1つを可能にICの入力は、個々の神経細胞体6,14の数百人から同時に個々の樹状突起棘13やレコード活動に到着。その結果、2光子顕微鏡のサブミクロンの空間分解能を有する結合内因性信号イメージングは、樹状細胞は、セグメントと新皮質内の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを正確に決定する可能性を提供しています。ここでは、急速に皮質方位マップを取得し、非げっ歯類哺乳動物における蛍光色素で神経細胞を標識するためのこの機能マップ内の特定のマイクロドメインを標的とするため、高収率の方法を示しています。二光子イメージングに使用されるのと同じ顕微鏡を用いて、我々は最初の内因性シグナル光学イメージングを用いた方位マップを生成します。その後、我々はどちらかのラベルに染料を用いて神経細胞体またはラベルの樹状突起棘と軸索がに表示されていることをこのような単一ニューロンの人口を読み込まマイクロピペットを用いて目的のマイクロドメインをターゲットにする方法を示しています生体。以前の方法に比べて我々の改良が新皮質の機能的なアーキテクチャの枠組みの中で、サブ細胞レベルの分解能を持つニューロンの構造と機能の関係の検討を容易にする。
Protocol
1。手術の準備麻酔を誘導し、連続的に心拍数を監視し、潮のCO 2、脳波、および温度を終了します。すべての手順は、サウスカロライナ医科大学の制度的動物実験委員会によって承認されたと我々は以前に9,15を公表したものに基づいていた。 メスの刃で皮膚を切断することによって頭蓋骨の背側表面を露出させる。 Brudonのキュレットを用いて骨を覆う…
Representative Results
私たちの色素標識法の精度を説明するために、我々は、非げっ歯類の新皮質内の任意の既知の機能マップの最小のマイクロドメインを対象とした。まばらに一次視覚野における方位マップ全体中断特異点である。これらは、すべての優先方位が配向性の偽カラーマップ、 "風車"（ 図2A-B）のような特異点を見て周りの地域ではそのような収束するポイントで発生します。?…
Discussion
我々は、新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける神経細胞体（または樹状突起と軸索）の標識を対象とする方法を提案する。二光子顕微鏡によるマージ固有信号光イメージングは、ニューロンの選択が機能してマップ内のニューロンの位置、および神経回路部品と相関するかどうかを、シナプス、細胞は任意の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを決定する可能性を提?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
図5Aに示すように樹状突起をトレースするためのグレース·ディオン;、この作品は、我々はまた、外科的処置の支援についてはマシューペトレルラに感謝国立眼研究所R01EY017925とR21EY020985とダナ·ホワイトホール財団からPKへの資金からの補助金によって支えられているとPratik氏Chhatbar用原稿についてのコメント。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
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Cite This Article
O’Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).