Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.
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Artículo de método
Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones
En este artículo
Resumen
Resumen
En la corteza visual primaria de los mamíferos no roedores, las neuronas se agrupan de acuerdo a su preferencia por las características del estímulo como la orientación 1-4, 5-7 dirección dominación, ocular 8,9 y disparidad binocular 9. Selectividad de orientación es la característica más ampliamente estudiado y un mapa continuo con un diseño cuasi-periódico de orientación preferida está presente en toda la corteza visual primaria 10,11. La integración de los aportes sinápticas, celular y de red que conducen a las respuestas de estímulos selectivos en estos mapas funcionales requiere de la hibridación de técnicas de imágenes que abarcan sub-micrón milímetros a escalas espaciales. Con los métodos convencionales de la señal óptica intrínseca, la disposición general de los mapas funcionales a lo largo de toda la superficie de la corteza visual se puede determinar 12. El desarrollo in vivo de dos fotones microscopía utilizando colorantes sensibles al calcio permite a uno determinar la SYNAPTentrada ic llegar a las espinas dendríticas individuales 13 o registro de actividad simultánea de cientos de los distintos órganos de células neuronales 6,14. Por consiguiente, la combinación de imágenes de señal intrínseca con la resolución submicrónica espacial de dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar exactamente qué segmentos dendríticas y células contribuyen a la micro-dominio de cualquier mapa funcional en el neocórtex. Aquí se demuestra un método de alto rendimiento para la rápida obtención de un mapa cortical y orientación dirigida a un microorganismo específico de dominio en este mapa funcional para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en un mamífero no roedora. Con el mismo microscopio usado para dos fotones de formación de imágenes, en primer lugar generar un mapa de orientación utilizando imágenes de señal óptica intrínseca. A continuación, le mostramos cómo dirigir una micro-dominio de interés utilizando una micropipeta cargada de tinte a cualquiera de etiqueta con una población de cuerpos de células neuronales o la etiqueta de una sola neurona de tal manera que las dendritas y los axones, las espinas son visibles envivo. Nuestros criterios de búsqueda sobre los métodos anteriores facilitar el examen de neuronales relaciones estructura-función con la sub-celular resolución en el marco de neocorticales arquitecturas funcionales.
Protocolo
1. Preparación quirúrgica
- Inducir la anestesia y vigilar continuamente la frecuencia cardíaca, terminar tidal CO 2, EEG, y la temperatura. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Médica de Carolina del Sur y se basaron en los que previamente publicada 9,15.
- Exponer la superficie dorsal del cráneo por el corte de la piel con una cuchilla de escalpelo. Separe los tejidos conectivos que recubren el hueso utilizando una cureta Brudon. Limpie el hueso utilizando aplicadores con punta de algodón y gasa de algodón. Aplique la cera ósea (según sea nece....
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Resultados
Para ilustrar la precisión de los métodos de etiquetado de tinte, nos centramos en las más pequeñas micro-dominio de cualquier mapa que sepa que funciona en el neocórtex no roedor. Escasamente salpicado por todo el mapa de orientación en la corteza visual primaria son singularidades. Esto ocurre en los puntos donde convergen todas las orientaciones preferentes de tal manera que en los mapas de falso color de la orientación preferida, las regiones de todo el aspecto singularidad como "molinillos" (Figur.......
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Discusión
Se presenta un método para dirigir el etiquetado de los cuerpos celulares neuronales (o dendritas y axones) en pre-determinados micro-dominios funcionales de la corteza cerebral. La fusión de imágenes de la señal óptica intrínseca con dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar que sinapsis y células contribuyen a la micro-dominio de cualquiera de los mapas funcionales, si correlatos neuronales selectividad con la ubicación de la neurona en un mapa funcional, y el circuito neuronal componentes que cambia.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de la National Eye Institute R01EY017925 y R21EY020985 y financiamiento de las Fundaciones de Dana y Whitehall a PK Agradecemos también a Mateo Petrella para obtener ayuda con los procedimientos quirúrgicos; Grace Dion para rastrear las dendritas se muestra en la Figura 5A, y Pratik Chhatbar para comentarios sobre el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / material | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |||||
| 1. El soporte de vida / experimento de preparación | ||||||||
| El isoflurano | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | ||||||
| Vaporizador de isoflurano | Midmark | VIP 3000 | ||||||
| Comentarios manta eléctrica regulada | Harvard Apparatus | 50-7079F | ||||||
| Del monitor de ECG | Digicare Biomédica | LifeWindow Lite | ||||||
| Amplificador de EEG | Sistemas AM | 1800 | ||||||
| Monitor de pantalla de EEG | Hewlett Packard | 78304A | ||||||
| Fin de marea de CO 2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimizar la ventilación | |||||
| Rebabas de metal duro de perforación para la perforación del hueso | Henry Schein | fino (0,5 mm punta) y gruesa (1,25 mm punta) | ||||||
| Cemento para placa cabezal / cámara | Dentsply | 675571, 675572 | ||||||
| Polvo negro Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Añadir al cemento para mejorar el blindaje de luz y reducir los reflejos | |||||
| Agarosa - Tipo III-A | Sigma | A9793 | Para minimizar las pulsaciones durante la señal intrínseca y la imagen de dos fotones | |||||
| Cubreobjetos: 5 o 8 mm de diámetro, 0,17 mm de espesor | En World Precisioninstrumentos | 502040, 502041 | Para minimizar las pulsaciones durante la exploración, el cubreobjetos se puede cortar según sea necesario | |||||
| Brudon curetas | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Limpieza de superficie del cráneo | |||||
| Bone cera | Ethicon | W31G | Rápidamente deja de sangrar | |||||
| Aplicador con punta de algodón | Microscopía Electrónica de Ciencias | 72308-05 | Hueso Limpie y seque la superficie | |||||
| Dumont # 5CO Pinzas | Herramientas Artes Ciencias | 11295-20 | Agarra capas individuales de duración o pia | |||||
| Tijeras Vannas Primavera | Herramientas Artes Ciencias | 15000-03 | Cut dura | |||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | Para detener la hemorragia en la duramadre | |||||
| Lanzas de absorción | Herramientas Artes Ciencias | 18105-01 | Absorción ultra rápida y libre de pelusa de CSF | |||||
| Blackout materiales | Thorlabs | BK5 | Escudo craneotomía | |||||
| 2. Teñir preparación / inyección | ||||||||
| Dimetil sulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | ||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | ||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcio indicador | |||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | ||||||
| Filtro centrífugo (0,45 micras de tamaño de poro) | Millipore | UFC30HV00 | Para eliminar las impurezas antes de la inyección | |||||
| Vidrio pipeta extractor | Sutter Instruments | P97 | ||||||
| Vidrio borosilicato filamented capilar (1,5 mm de diámetro exterior) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Pipeta de expulsión Dye | |||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | Para cargar un tinte en una pipeta | |||||
| Micromanipulador | Sutter Instruments | MP-285 | Para posicionar pipeta | |||||
| Regulador de presión de pulso | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | Para la inyección de la presión del colorante | |||||
| De celda única electroporador | Molecular Devices | Axoporator 800A | Para la electroporación del colorante | |||||
| 3. Intrínseca imaging | ||||||||
| Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) | Olimpo | UPLFLN4X | ||||||
| Intrínseca hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software se utiliza para la formación de imágenes episódica | |||||
| Cámara CCD | Adimec | Adimec-1000 | ||||||
| Fuente de luz Fuente de alimentación | KEPCO | ATE-15M 15 | ||||||
| Fuente de luz | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | La intensidad de luz en la superficie cortical es de 3-5 mW | |||||
| Filtro verde (para una imagen vascular) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (paso de banda de 30 nm) | Para la imagen de referencia de la superficie de la vasculatura | |||||
| Filtro rojo (para la señal intrínseca) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (paso de banda de 30 nm) | Para recoger señales intrínsecas | |||||
| Heat filtro | Optical Imaging Inc. | KG-1 | ||||||
| 4. Dos fotones de plataforma / imagen | ||||||||
| Dos fotones de microscopio y software | Tecnologías de la Prairie | Ver Shen et al. 2012 para paso de luz, filtros y potencia del láser | ||||||
| Ti: Sapphire láser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | ||||||
| 20x (0,5 NA, 3,5 mm WD) | Olimpo | UMPLFLN20X | 0,5 NA objetivo sólo se utiliza para la alineación de pipeta sobre la craneotomía (no para dos imágenes de fotón) | |||||
| 20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) | Olimpo | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) | Olimpo | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| Air tabla | Newport | ST-200 | Aísla preparación de las vibraciones externas | |||||
| xy etapa | Mike Machine Co. (Attleboro, MA) | Sujeto experimental y micromanipulador Sutter colocado en el escenario xy | ||||||
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Referencias
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....
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Reimpresiones y permisos
