Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones
Summary
Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.
Abstract
En la corteza visual primaria de los mamíferos no roedores, las neuronas se agrupan de acuerdo a su preferencia por las características del estímulo como la orientación 1-4, 5-7 dirección dominación, ocular 8,9 y disparidad binocular 9. Selectividad de orientación es la característica más ampliamente estudiado y un mapa continuo con un diseño cuasi-periódico de orientación preferida está presente en toda la corteza visual primaria 10,11. La integración de los aportes sinápticas, celular y de red que conducen a las respuestas de estímulos selectivos en estos mapas funcionales requiere de la hibridación de técnicas de imágenes que abarcan sub-micrón milímetros a escalas espaciales. Con los métodos convencionales de la señal óptica intrínseca, la disposición general de los mapas funcionales a lo largo de toda la superficie de la corteza visual se puede determinar 12. El desarrollo in vivo de dos fotones microscopía utilizando colorantes sensibles al calcio permite a uno determinar la SYNAPTentrada ic llegar a las espinas dendríticas individuales 13 o registro de actividad simultánea de cientos de los distintos órganos de células neuronales 6,14. Por consiguiente, la combinación de imágenes de señal intrínseca con la resolución submicrónica espacial de dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar exactamente qué segmentos dendríticas y células contribuyen a la micro-dominio de cualquier mapa funcional en el neocórtex. Aquí se demuestra un método de alto rendimiento para la rápida obtención de un mapa cortical y orientación dirigida a un microorganismo específico de dominio en este mapa funcional para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en un mamífero no roedora. Con el mismo microscopio usado para dos fotones de formación de imágenes, en primer lugar generar un mapa de orientación utilizando imágenes de señal óptica intrínseca. A continuación, le mostramos cómo dirigir una micro-dominio de interés utilizando una micropipeta cargada de tinte a cualquiera de etiqueta con una población de cuerpos de células neuronales o la etiqueta de una sola neurona de tal manera que las dendritas y los axones, las espinas son visibles envivo. Nuestros criterios de búsqueda sobre los métodos anteriores facilitar el examen de neuronales relaciones estructura-función con la sub-celular resolución en el marco de neocorticales arquitecturas funcionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un método para dirigir el etiquetado de los cuerpos celulares neuronales (o dendritas y axones) en pre-determinados micro-dominios funcionales de la corteza cerebral. La fusión de imágenes de la señal óptica intrínseca con dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar que sinapsis y células contribuyen a la micro-dominio de cualquiera de los mapas funcionales, si correlatos neuronales selectividad con la ubicación de la neurona en un mapa funcional, y el circuito neuronal componentes q…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la National Eye Institute R01EY017925 y R21EY020985 y financiamiento de las Fundaciones de Dana y Whitehall a PK Agradecemos también a Mateo Petrella para obtener ayuda con los procedimientos quirúrgicos; Grace Dion para rastrear las dendritas se muestra en la Figura 5A, y Pratik Chhatbar para comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
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