JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Neuroscience

Målrettet Mærkning af neuroner i en specifik funktionel Micro-domæne af neocortex Ved at kombinere Intrinsic-signalet og to-foton Imaging

Published: December 12, 2012
doi:
10.3791/50025
, , , , ,
1Department of Neuroscience,Medical University of South Carolina

Summary

Der beskrives en fremgangsmåde til mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer i forudbestemte funktionelle mikro-domæner i neocortex. For det første er iboende signal optisk billeddannelse anvendes til at opnå et funktionelt kort. Derefter to-foton mikroskopi anvendes til at mærke og billed neuroner i en mikro-domæne af kortet.

Abstract

I den primære visuelle cortex af ikke-gnavere pattedyr, er neuroner klynger efter deres præference for stimulus funktioner såsom orientering 1-4, retning 5-7, okulær dominans 8,9 og kikkert ulighed 9. Orientering selektivitet er den mest undersøgte funktion og en kontinuerlig kort med en kvasi-periodisk layout for foretrukken orientering er til stede over hele den primære visuelle cortex 10,11. Integration de synaptiske, cellulære og netværk bidrag, der fører til stimulus selektive svar i disse funktionelle maps kræver hybridisering af billeddannende teknikker, der spænder over sub-mikron til millimeter rumlige skalaer. Med konventionel iboende signal optisk billeddannelse, kan det generelle layout af de funktionelle kort over hele overfladen af den visuelle cortex bestemmes 12. Udviklingen af in vivo to-foton mikroskopi under anvendelse af calcium-følsomme farver gør det muligt at bestemme synaptic-indgang ankommer til de enkelte dendritiske Torner 13 eller optage aktivitet samtidig fra hundredvis af individuelle neuronale cellelegemer 6,14. Derfor kombinerer iboende signal billeddannelse med sub-micron rumlig opløsning af to-foton mikroskopi giver mulighed for bestemmelse af præcis hvilke dendritiske segmenter og celler bidrager til mikro-domænet af et funktionelt kort i neocortex. Her viser vi et højt udbytte fremgangsmåde til hurtig opnåelse af en cortical orientering kort og med et bestemt mikro-domænet i denne funktionelle kort til mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer i en ikke-gnaver pattedyr. Med samme mikroskop bruges til to-foton billedbehandling, vi først generere en orientering kortet ved hjælp af iboende signal optisk billeddannelse. Så vi vise, hvordan man målrette en mikro-domæne af interesse ved hjælp af en mikropipette lastet med farvestof til enten etiket en population af neuronale cellelegemer eller etiket en enkelt neuron, således at dendritter, pigge og axoner er synlige ivivo. Vores finjusteringer i forhold til tidligere metoder letter en undersøgelse af neuronale struktur-funktion relationer med sub-cellulær beslutning inden for rammerne af neocortical funktionelle arkitekturer.

Protocol

1. Kirurgisk forberedelse Inducere anæstesi og løbende overvåge puls, ende tidevandsenergi CO2, EEG og temperatur. Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg det medicinske universitet i South Carolina og var baseret på dem, vi tidligere har udgivet 9,15. Blotlægge den dorsale overflade af kraniet ved at skære i huden med et skalpelblad. Dissekere bindevævet ligger over knoglen ved hjælp af en Brudon curette. Rengør knoglen ved hjælp af …

Representative Results

For at illustrere præcisionen af ​​vores farvestof mærkningsmetoder, vi målrettet den mindste mikro-domæne for enhver kendt funktionelt kort i den ikke-gnaver neocortex. Tyndt præget igennem orienteringen kortet i den primære visuelle cortex er singulariteter. Disse forekommer ved punkter, hvor alle foretrukne orienteringer konvergerer således, at i falske farve kort af foretrukken orientering, regionerne omkring singularitet ligne "vejrhaner" (fig. 2A-B). Én mølle pr kraniotomi e…

Discussion

Vi præsenterer en fremgangsmåde til at målrette mærkning af neuronale cellelegemer (eller dendritter og axoner) i forudbestemte funktionelle mikro-domæner i neocortex. Sammenfletning iboende signal optisk billeddannelse med to-foton mikroskopi giver mulighed for bestemmelse af, hvilke synapser og celler bidrager til mikro-domænet af et funktionelt kort, hvad enten neuronale selektivitet korrelerer med placeringen af ​​neuron i et funktionelt kort, og det neuronale kredsløbskomponenter denne ændring med visue…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Eye Institute R01EY017925 og R21EY020985 og finansiering fra Dana & Whitehall Foundations til PK Vi takker også Matthew Petrella for assistance med kirurgiske procedurer, Grace Dion til sporing dendriterne vist i figur 5A og Pratik Chhatbar for kommentarer til manuskriptet.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
      1. Life support/experiment prep
Isoflurane Webster Vet NDC 57319-474-05  
Isoflurane vaporizer Midmark VIP 3000  
Feedback regulated heating blanket Harvard Apparatus 50-7079F  
ECG monitor Digicare Biomedical LifeWindow Lite  
EEG amplifier A-M Systems 1800  
EEG display monitor Hewlett Packard 78304A  
End tidal CO2 monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone Henry Schein fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)  
Cement for headplate/chamber Dentsply 675571, 675572  
Black Powder Tempera Paint Sargent Art Inc. 22-7185 Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose – Type III-A Sigma A9793 For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness World Precision Instruments 502040, 502041 For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Cleaning skull surface
Bone wax Ethicon W31G Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator Electron Microscopy Sciences 72308-05 Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps Fine Science Tools 11295-20 Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 To stop bleeding on the dura
Absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material Thorlabs BK5 Shield craniotomy
      2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO) Sigma D2650  
Pluronic Sigma P2443  
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcium indicator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438  
Centrifugal filter (0.45 μm pore size) Millipore UFC30HV00 To remove impurities before injection
Glass pipette puller Sutter Instruments P97  
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) World Precision Instruments 1B150F-4 Dye ejection pipette
Microloader Eppendorf 5242 956 003 For loading dye into pipette
Micromanipulator Sutter Instruments MP-285 To position pipette
Pressure pulse controller Parker Hannifin PicoSpritzer III For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator Molecular Devices Axoporator 800A For electroporation of the dye
      3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) Olympus UPLFLN4X  
Intrinsic hardware / software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera Adimec Adimec-1000  
Light source power supply KEPCO ATE 15-15M  
Light source Optical Imaging Inc. HAL 100 Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (bandpass 30 nm) For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal) Optical Imaging Inc. λ = 630 nm (bandpass 30 nm) To collect intrinsic signals
Heat filter Optical Imaging Inc. KG-1  
      4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software Prairie Technologies   See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai XF  
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) Olympus UMPLFLN20X 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) Olympus XLUMPLFLN20X  
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) Olympus LUMPLFLN40X/IR  
Air table Newport ST-200 Isolates preparation from external vibrations
xy stage Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)   Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
     
Recipes
Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4
Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Tags

Targeted LabelingNeuronsFunctional Micro-domainNeocortexIntrinsic SignalTwo-photon ImagingOrientation SelectivityFunctional MapsDendritic SpinesCell BodiesStructure-function RelationshipsSub-cellular ResolutionNon-rodent MammalsPrimary Visual Cortex
check_url/50025?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
O’Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image