Målrettet Merking av nevroner i en bestemt Funksjonell Micro-domenet neocortex ved å kombinere Intrinsic Signal og to-foton Imaging
Summary
En fremgangsmåte er beskrevet for merking nevroner med fluorescerende fargestoffer i forutbestemte funksjonelle mikro-domener av neocortex. Først, egenverdi signal optisk imaging brukes for å oppnå en funksjonell kart. Deretter to-foton mikroskopi brukes for å merke og image nevroner innenfor mikro-domene på kartet.
Abstract
I den primære visuelle cortex av ikke-gnagere pattedyr, er nervecellene gruppert i henhold til deres preferanser for stimulans funksjoner som 1-4 orientering, retning 5-7, okulær dominans 8,9 og kikkert 9 ulikhet. Orientering selektivitet er den mest studerte funksjonen og en kontinuerlig kart med en kvasi-periodisk oppsett for foretrukket retning er tilstede over hele primær visuelle cortex 10,11. Integrering av synaptiske, mobil og nett bidrag som fører til stimulans selektive tiltak i disse funksjonelle kart krever hybridisering av imaging teknikker som spenner sub-micron til millimeter romlige skalaer. Med konvensjonell egenverdi signal optisk avbildning, kan den totale utformingen av funksjonelle kartene over hele overflaten av den visuelle cortex bestemmes 12. Utvikling av in vivo to-foton mikroskopi hjelp kalsium sensitive fargestoffer muliggjør en å bestemme synaptic inngang ankommer enkelte dendrittiske spines 13 eller registrere aktivitet samtidig fra hundrevis av individuelle nevrale celle organer 6,14. Følgelig kombinerer egenverdi signal avbilding med sub-mikron romlig oppløsning av to-foton mikroskopi tilbyr muligheten for å bestemme nøyaktig hvilken dendrittiske segmenter og celler bidrar til mikro-domene noen funksjonell kart i neocortex. Her viser vi en high-yield metode for å raskt få en cortical orientering kart og rettet mot en bestemt mikro-domene i denne funksjonelle kart for merking nevroner med fluorescerende fargestoffer i en ikke-gnagere pattedyr. Med samme mikroskop brukes til to-foton bildebehandling, må vi først generere en orientering kart ved hjelp av iboende signal optisk imaging. Da viser vi hvordan å målrette en mikro-domenet av interesse ved hjelp av en mikropipette lastet med fargestoff til enten etiketten en befolkning på neuronal celle organer eller etikett en enkelt nervecelle slik at dendritter, spines og aksoner er synlige ivivo. Våre avgrensninger i forhold til tidligere metoder rette for en undersøkelse av neuronal struktur-funksjon relasjoner med sub-mobilnettet oppløsning innenfor rammen av neocortical funksjonelle arkitekturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterer en metode for å målrette merking av neuronal celle organer (eller dendritter og aksoner) i forhåndsbestemte funksjonelle mikro-domener neocortex. Sammenslåing egenverdi signal optisk imaging med to-foton mikroskopi tilbyr muligheten for å bestemme hvilke synapser og celler bidrar til mikro-domene noen funksjonell kart, enten nevronale selektivitet korrelerer med plasseringen av nevron i en funksjonell kart, og nevronale kretskomponenter som endrer seg med visuell opplevelse 7 eller anvende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Eye Institute R01EY017925 og R21EY020985 og finansiering fra Dana & Whitehall Foundations til PK Vi vil også takke Matthew Petrella for å få hjelp med kirurgiske prosedyrer, Grace Dion for å spore dendritter vist i figur 5A, og Pratik Chhatbar for kommentarer til manuskriptet.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose – Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
