Электропорации Hindbrain Трейс аксонов траектории и Synaptic Цели у эмбрионов кур
Summary
Как нейронных сетей устанавливаются в эмбриональном мозге является фундаментальным вопросом в развитии нейробиологии. Здесь мы объединили метод электропорации с новых генетических инструментов, таких как Cre / LOX-плазмиды и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в заднем мозге птичьего маркировать интернейронов спинного и отслеживать их аксональное прогнозы и синаптических целей на различных стадиях развития.
Abstract
Электропорации цыпленок эмбриональной нервной трубки имеет много преимуществ, таких как быстрое и эффективное для экспрессии чужеродных генов в нервных клетках. В этой рукописи мы предлагаем способ, который демонстрирует, как однозначно электропорации ДНК в мозге на птичьем E2.75 для того, чтобы специально маркировать подмножество нейронных предшественников, и как следовать их аксональное прогнозы и синаптической цели на много продвинутых стадиях разработки, до E14.5. Мы использовали новые генетические инструменты, включая конкретные элементы усилителя, Cre / Жидкий кислород – на основе плазмид и PiggyBac ДНК-опосредованного переноса системы в целях обеспечения GFP выражение в подтип заднего мозга клеток (спинной наиболее подгруппе интернейронов, dA1). Траектории аксонов и задач dA1 аксоны следуют на ранних и поздних стадиях эмбриогенеза в различных регионах мозга. Эта стратегия способствует передовые методы таргетинга интерес клетки в эмбриональном мозге и траCING схемы формирования на различных стадиях развития.
Introduction
Задний мозг представляет одного из ключевых узлов реле нервной системы, общаясь между центральной и периферической нервной системы с помощью восходящих и нисходящих нейронных сетей. Он регулирует основные функции, включая дыхание, сознание, слуха, координации движений и 1-3. Во время раннего эмбрионального развития, заднего мозга позвоночных временно разделена по его передне-задней (AP) оси в повторяющихся ромбомеры, в которых различные типы клеток нейронов формируются и создания нескольких центров ядер ствола мозга 4. Задний мозг также разделен вдоль его спинной-вентральной (DV) оси в базальной и крыльев пластины, на которой дискретных нейронных предшественников стать указан и дифференцироваться в различных местах DV 3,5,6. Как раннее AP и DV-конкретные нейронные паттерны, регулирующие создание функциональной схемами мозга в значительной степени неизвестно.
Чтобы получить знания по этой фундаментальнойВопрос, инструменты необходимы для того, чтобы обозначить конкретные группы нейронов в мозге и ранней проследить их аксональное траекторий и связи на более поздних стадиях. Ранее мы уже использовали конкретных элементов усилителя, и Cre / LoxP основе системы условного выражения для отслеживания траектории аксональное задних спинальных интернейронов в начале куриного эмбриона 7-9. В текущем рукописи мы нацелены на заднем мозге и модернизированные экспериментальной парадигмы для маркировки поздних эмбриональных интернейронов заднего мозга, аксоны и их синаптических целей, с использованием модифицированной стратегии электропорации и PiggyBac – опосредованного переноса ДНК. Наши новые стратегии позволяет пометки различных подтипов нейронов в одну сторону заднего мозга и отслеживание их аксонального проекции и синаптической сайтов на различных стадиях эмбриогенеза, от 2 до 12 дней после электропорации. На основе этого метода, мы обозначили наиболее спинно-подгруппе интернейронов заднего мозга (dA1/Atoh1 + </sдо> клетки) и выявили две противоположной восходящей аксональное проекции моделей, каждая вытекает из другого места АП и удлиняется в отдельном канатика. dA1 аксоны были обнаружены проекта и форма синапсов в слуховых ядер среднего мозга и в несколько слоев мозжечка 10.
Сочетание электропорации цыпленок, генетические отслеживания нейронов и анализ проекции места на гораздо поздних стадиях развития предоставляет уникальную платформу для изучения формирования нейронных сетей в мозге и выяснить молекулярные механизмы, которые управляют схемой формирования.
Protocol
Representative Results
Discussion
В ово электропорации является выполнимой, надежный и эффективный инструмент для изучения спецификации клеток и аксонов во куриных развития нервной системы 20. В этом протоколе мы опишем способ электропорации у кур на заднем мозге E2.75 использованием усилителя элементы, котор…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
