ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ
Summary
発達神経生物学の根本的な問題はどのように神経細胞のネットワークが胚の脳の中で確立されています。ここでは、そのようなのCre / LOX-プラスミドおよび背側介在ニューロンにラベルを付け、様々な発達段階でそれらの軸索投射やシナプスの標的を追跡する鳥類の後脳におけるpiggyBacを媒介DNA転位システムなどの小説の遺伝的なツール、とエレクトロポレーション技術を組み合わせた。
Abstract
ニワトリ胚の神経管のエレクトロポレーションは、例えば、神経細胞への外来遺伝子の発現のための迅速かつ効率的なものとして多くの利点を有する。本稿で我々は、特に神経前駆細胞のサブセットにラベルを付けるために、E2.75で鳥類の後脳にDNAをエレクトロする方法を一意に示し方法、どのように開発のより高度な段階で、その軸索投射やシナプスの目標に従うことを提供しますまでE14.5まで。ベースのプラスミドおよび後脳細胞（ニューロン、DA1の背最もサブグループ）のサブタイプでGFPの発現を駆動するpiggyBacを媒介DNA転位システム – 私たちは、特定のエンハンサーエレメント、Creを/ロックス含む小説遺伝のツールを利用してきた。 DA1軸索の軸索軌道と目標は、さまざまな脳幹領域に初期および後期胚の段階で続いている。この戦略は、胚後脳における目的の細胞を標的とするためとTRAのための高度な技術に貢献開発の複数の段階での回路形成をcing。
Introduction
後脳は、神経回路網を昇順と降順を介して、中枢および末梢神経系の間で通信することにより、神経系の主要な中継ハブを表しています。それは呼吸、意識、聴覚、およびモータ協調1-3を含む基本的な機能を調節する。初期胚発生時には、脊椎動物の後脳を一過異なる神経細胞型が形成され、複数の脳幹核センター4が生成されている反復的な菱へとその前後（AP）軸に沿って分割されます。後脳はまた、個別の神経前駆細胞は、指定されたとなり、明確なDVの場所3,5,6で分化れる基底とエイラープレートにその背腹（DV）軸に沿って分割されています。どのように早期のAPとDV固有ニューロンのパターンが機能脳幹回路網の確立を支配していることはあまり知られていない。
この基本的な知識を得るために質問、ツールは早い後脳の神経細胞の特定のサブセットにラベルを付けると、より高度な段階でそれらの軸索の軌道と接続性をトレースするために必要です。我々は以前、特定のエンハンサーエレメント、および早期のニワトリ胚7-9に背側脊髄介在ニューロンの軸索軌道を追跡するためのCre /のLoxPベースの条件式のシステムを利用してきた。現在の原稿では、後脳を対象とし、修正されたエレクトロポレーション戦略とpiggyBacを使用して、後期胚後脳ニューロン、軸索とそのシナプスの標的を標識するための実験的なパラダイムをアップグレードした – 媒介DNAの転置を。私たちの新しい戦略は、エレクトロポレーション後2までの12日から、後脳の片側に異なる神経細胞サブタイプのタグ付け、様々な胚の段階でそれらの軸索投射やシナプスのサイトのトラッキングを可能にします。この方法に基づき、我々は後脳ニューロン（dA1/Atoh1 +の背ほとんどサブグループのラベルが付いた</sアップ>細胞）および2対昇順軸索投射パターンを明らかにし、それぞれが異なる索内の別のAPの位置と伸長に由来しています。 DA1軸索は、プロジェクトと聴覚核、中脳および小脳10の複数の層のフォームシナプスに発見された。
ひよこのエレクトロポレーションの組み合わせは、遺伝的にはニューロンと開発の多くの先進的な段階で投影サイトの分析のトレース、脳内の神経ネットワークの形成を研究するために、回路形成を支配する分子メカニズムを解明するユニークなプラットフォームを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
OVOエレクトロポレーションでひよこ神経系の発達の間に20セルの仕様と軸索ガイダンスを検査するために、実現可能な信頼性の高い、効果的なツールです。このプロトコルでは、特定のニューロンの条件付きラベルを有効にエンハンサーエレメントを使用してE2.75でニワトリ後脳におけるエレクトロポレーションのモードを説明します。この戦略は、胚発生の高度な段階…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
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