Elektroporation des Hinterhirn zu Axonal Trajectories und Synaptic Treffer in der Embryo-Küken Trace
Summary
Wie neuronale Netze sind in der embryonalen Gehirn etabliert ist eine grundlegende Frage in Entwicklungsneurobiologie. Hier haben wir eine Elektroporation kombiniert Technik mit neuartigen genetischen Werkzeugen, wie Cre / Lox-Plasmiden und DNA-vermittelte PiggyBac Umsetzung System in der aviären hindbrain nach dorsal Interneuronen kennzeichnen und verfolgen ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele auf verschiedenen Entwicklungsstadien.
Abstract
Elektroporation des Kükenembryonen Neuralrohr hat viele Vorteile, als schnell und effizient zur Expression fremder Gene in neuronalen Zellen. In diesem Manuskript bieten wir eine Methode, die eindeutig zeigt, wie DNA in das Vogelgrippe hindbrain elektroporieren bei E2.75 um spezifisch zu markieren eine Teilmenge von neuronalen Vorläuferzellen, und wie sie ihre axonalen Projektionen und synaptische Ziele bei viel fortgeschrittenen Stadien der Entwicklung zu folgen, bis E14.5. Basierten Plasmiden und der PiggyBac DNA-vermittelte Umsetzung System GFP-Expression in einem Subtyp von hindbrain Zellen (die dorsale meisten Untergruppe von Interneuronen dA1) fahren – Wir haben neue genetische Werkzeuge einschließlich spezifischer Enhancer-Elemente, Cre / Lox genutzt. Axonal Bahnen und Ziele dA1 Axone sind in der frühen und späten embryonalen Stadien an verschiedenen Hirnstamm Regionen gefolgt. Diese Strategie trägt fortgeschrittene Techniken zur gezielten Zellen von Interesse in der embryonalen hindbrain und traCing Schaltung Bildung in mehreren Stufen der Entwicklung.
Introduction
Die hindbrain stellt einen wichtigen Relais Nabe des Nervensystems durch die Kommunikation zwischen den zentralen und peripheren Nervensystems über-und absteigenden neuronalen Netzen. Es regelt grundlegende Funktionen wie Atmung, Bewusstsein, Gehör und Motorik 1-3. Während der frühen embryonalen Entwicklung wird der Wirbeltiere hindbrain transient entlang seiner anterior-posterioren (AP) Achse in sich wiederholenden Rhombomere, in denen verschiedene neuronale Zelltypen gebildet werden und erzeugen mehrere Hirnstammkerne Zentren 4 unterteilt. Die hindbrain wird auch entlang der dorsal-ventralen (DV) Achse in eine basale und alar Platte, an dem diskreten neuronalen Vorläuferzellen werden angegeben und differenzieren in verschiedene Standorte DV 3,5,6 unterteilt. Wie die frühen AP und DV-spezifische neuronale Muster sind für die Errichtung von funktionellen Schaltkreisen Hirnstamm ist weitgehend unbekannt.
Um Wissen zu diesem grundlegenden gewinnenFrage, sind Werkzeuge erforderlich, um bestimmte Untergruppen von Neuronen im frühen hindbrain beschriften und ihre axonalen Bahnen und Konnektivität bei fortgeschrittenen Stadien zu verfolgen. Wir haben zuvor spezifische Enhancer-Elemente verwendet, und eine Cre / loxP-basierten bedingten Ausdruck System für die Verfolgung axonal Flugbahn des dorsalen spinalen Interneuronen in den frühen Hühnerembryozellen 7-9. In der aktuellen Manuskript haben wir die hindbrain gezielt und aktualisiert die experimentelle Paradigma zur Kennzeichnung späten embryonalen hindbrain Interneuronen, Axone und deren synaptischen Ziele, mit einer modifizierten Elektroporation Strategie und die PiggyBac – vermittelte DNA Umsetzung. Unsere neue Strategie ermöglicht die Kennzeichnung von verschiedenen neuronalen Subtypen in einer Seite des hindbrain und die Verfolgung ihrer axonalen Projektionen und synaptische Sites an verschiedenen embryonalen Stadien, von 2 bis 12 Tage nach der Elektroporation. Basierend auf dieser Methode, beschriftet wir die meisten dorsal-Untergruppe von hindbrain Interneuronen (dA1/Atoh1 + </sup> Zellen) und zeigte zwei kontralaterale steigend axonale Projektion Muster leitet jeder von einem anderen AP Lage und dehnt sich in einer deutlichen funiculus. dA1 Axone wurden Projekt und das Formular Synapsen im auditorischen Kerne, Mittelhirn und in mehreren Schichten des Kleinhirns 10 gefunden.
Die Kombination von Küken Elektroporation genetischen Rückverfolgung von Neuronen und Analyse Projektionsstellen bei viel fortgeschrittenen Entwicklungsstadium bietet eine einzigartige Plattform, um die Bildung von neuronalen Netzwerken im Gehirn zu untersuchen und molekularen Mechanismen, die Schaltung Bildung regeln aufzuklären.
Protocol
Representative Results
Discussion
In ovo Elektroporation ist eine praktikable, zuverlässige und wirksames Instrument, um Zellspezifikation und axonalen Wegfindung während der Entwicklung des Nervensystems chick 20 zu untersuchen. In diesem Protokoll beschreiben wir einen Modus der Elektroporation in das Küken hindbrain bei E2.75 mit Enhancer-Elemente, die die bedingte Kennzeichnung bestimmter Interneurone aktivieren. Diese Strategie wird mit dem PiggyBac-vermittelte Umsetzung System, um fremde Gene in das Genom Küken, die der axo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
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