Electroporation של המוח האחורי כדי לעקוב אחר מסלולים ויעדי axonal Synaptic בעובר האפרוח
Summary
איך רשתות עצביות נוצרות במוח העוברי היא שאלה בסיסית בנוירוביולוגיה התפתחותית. כאן אנו בשילוב טכניקת electroporation עם כלים גנטיים חדשים, כגון מערכת טרנספוזיציה DNA PiggyBac בתיווך במוח האחורי העופות לתייג interneurons גב ולעקוב אחר תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבי התפתחות שונים Cre / קס-פלסמידים ו.
Abstract
Electroporation של הצינור העצבי החומוס העוברי יש יתרונות רבים כגון להיות מהיר ויעיל לביטוי של גנים זרים לתוך תאים עצביים. בכתב היד הזה אנו מספקים שיטה ייחודית המדגימה כיצד electroporate דנ"א לתוך המוח האחורי העופות בE2.75 כדי לתייג את קבוצת משנה של אבות עצביים באופן ספציפי, וכיצד לעקוב אחרי תחזיות axonal ומטרות סינפטיים בשלבים מתקדמים הרבה של פיתוח, עד E14.5. יש לנו מנוצלים כלים גנטיים חדשים כולל אלמנטים ספציפיים משפר, Cre / קס – פלסמידים מבוססי ומערכת ה-DNA טרנספוזיציה PiggyBac בתיווך לנהוג ביטוי של GFP בתת סוג של תאי מוח אחוריים (רוב תת קבוצה של interneurons הגבי, dA1). מסלולים ויעדים של dA1 האקסונים axonal הם אחריו בשלבים עובריים מוקדמים ומאוחר באזורי גזע מוח שונים. אסטרטגיה זו תורמת טכניקות מתקדמות למיקוד תאים של עניין במוח האחורי העוברי ועבור טרהcing היווצרות מעגלים בשלבים שונים של פיתוח.
Introduction
המוח האחורי מייצג רכזת ממסר מרכזית של מערכת העצבים על ידי תקשורת בין מערכות העצבים המרכזיות והיקפיות באמצעות עולה ויורד רשתות נוירונים. הוא מווסת את פונקציות בסיסיות כולל נשימה, תודעה, שמיעה, ומוטורי תיאום 1-3. במהלך ההתפתחות עוברית מוקדמת, המוח האחורי החוליות מחולק transiently לאורך הציר (AP) קדמי, האחורי שלה לתוך rhombomeres חוזרת ונשנית, שבו תאים מסוגים שונים עצביים נוצרים וליצור מרכזי גרעיני גזע מוח מספר 4. המוח האחורי מחולק גם לאורך הציר (DV) גב, גחונו לתוך צלחת בסיס ועלאר, שבו אבות עצביים בדידים להפוך צוינו ולהבדיל במקומות שונים DV 3,5,6. איך מוקדם AP וDV ספציפיים הדפוסים עצביים המסדירים את הקמתה של circuitries גזע המוח תפקודי הוא במידה רבה לא ידוע.
כדי לצבור ידע על זה בסיסישאלה, כלים הנדרשים כדי לתייג תת ספציפית של תאי עצב במוח האחורי מוקדם ולעקוב אחר המסלולים וקישוריות axonal בשלבים מתקדמים יותר. יש לנו מנוצלים בעבר אלמנטים משפר ספציפיים, ומערכת משפט תנאי Cre / מבוסס LoxP למעקב אחר המסלול של axonal interneurons השדרה הגבי בעובר האפרוח מוקדם 7-9. בכתב היד הנוכחית יש לנו ממוקד למוח האחורי ומשודרג פרדיגמה הניסויית לתיוג interneurons המאוחר עוברי המוח האחורי, אקסונים והיעדים סינפטיים שלהם, משתמש באסטרטגיה שונה וelectroporation PiggyBac – טרנספוזיציה DNA התיווך. האסטרטגיה החדשה שלנו מאפשרת התיוג של תת עצביים נפרדים בצד אחד של המוח האחורי ואת המעקב של תחזיות axonal ואתרים סינפטיים בשלבים עובריים שונים, מ -2 עד 12 ימים לאחר electroporation. המבוסס על שיטה זו, אנו הכותרת הגבי ביותר תת קבוצה של interneurons המוח האחורי (dA1/Atoh1 + </s> תאים למעלה) וחשף שני דפוסי הקרנת axonal עולים נגדיים, כל אחד נובע ממיקום AP שונה ומתארכת בחבל טבור מובהק. dA1 אקסונים נמצאו פרויקט וסינפסות טופס בשמיעת גרעינים, המוח התיכון ובשכבות מרובות של המוח הקטן 10.
שילוב של electroporation האפרוח, התחקות הגנטית של תאי עצב וניתוח של אתרי הקרנה בשלבים מתקדמים של פיתוח רבים מספק פלטפורמה ייחודית ללמוד את היווצרותם של רשתות עצביות במוח ועל מנת להבהיר מנגנונים מולקולריים השולטים היווצרות מעגל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב electroporation אובו הוא כלי אפשרי, אמין, יעיל ולבחון מפרט תא והכוונה axonal במהלך אפרוח פיתוח מערכת עצבים 20. בפרוטוקול זה אנו מתארים מצב של electroporation במוח האחורי החומוס בE2.75 באמצעות משפר אלמנטים המאפשרים תיוג המותנה של interneurons הספציפי. אסטרטגיה זו היא בשילוב עם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
