Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo
Summary
Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.
Abstract
Elektroporatie van het kuiken embryonale neurale buis heeft vele voordelen zoals het snel en efficiënt voor de expressie van vreemde genen in neuronale cellen. In dit manuscript bieden we een methode die uniek laat zien hoe DNA electroporate in de aviaire hindbrain op E2.75 om specifiek label een subset van neuronale voorlopercellen, en hoe ze hun axonale projecties en synaptische doelen volgen op veel geavanceerde stadia van ontwikkeling, tot E14.5. We hebben gebruik gemaakt van nieuwe genetische tools, waaronder specifieke enhancer elementen, Cre / Lox – gebaseerde plasmiden en de piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem om GFP expressie rijden in een subtype van hindbrain cellen (de dorsale grootste subgroep van interneuronen, DA1). Axonale trajecten en doelstellingen van DA1 axonen worden gevolgd bij vroege en late embryonale stadia bij verschillende hersenstam regio. Deze strategie draagt geavanceerde technieken voor targeting cellen van belang in de embryonale achterhersenen en voor tracing vorming circuit op verschillende stadia van ontwikkeling.
Introduction
De hindbrain vertegenwoordigt een belangrijke relais knooppunt van het zenuwstelsel door te communiceren tussen de centrale en perifere zenuwstelsel via stijgende en dalende neuronale netwerken. Het regelt basisfuncties zoals ademhaling, bewustzijn, gehoor, en motorische coördinatie 1-3. Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling, wordt de gewervelde hindbrain tijdelijk opgedeeld langs de anterior-posterior (AP) as in repetitieve rhombomeres, waarin verschillende neuronale celtypes worden gevormd en het genereren van meerdere hersenstamkernen centra 4. De hindbrain is ook verdeeld langs de dorsale-ventrale (DV)-as in een basale en alar plaat, waarbij discrete neuronale voorlopercellen worden gespecificeerd en differentiëren in verschillende DV locaties 3,5,6. Hoe de vroege AP en DV-specifieke neuronale patronen zijn voor de instelling van functionele hersenstam circuitries is grotendeels onbekend.
Om kennis te verwerven over deze fundamentelebetrokken zijn gereedschap nodig om specifieke subsets van neuronen in de vroege achterhersenen label en hun axonale trajecten en connectiviteit sporen op meer gevorderde stadia. We hebben eerder gebruikte specifieke enhancer elementen, en een Cre / loxP based voorwaardelijke expressie systeem om axonale wijze dorsale spinale interneuronen in de vroege kippenembryo 7-9. In het huidige manuscript hebben we de hindbrain gerichte en een upgrade van de experimentele paradigma voor de etikettering late embryonale hindbrain interneuronen, axonen en hun synaptische doelstellingen, met behulp van een gemodificeerde elektroporatie strategie en de piggyBac – gemedieerde DNA-omzetting. Onze nieuwe strategie maakt het labelen van verschillende neuronale subtypes in een kant van de achterhersenen en de positie van hun axonale uitsteeksels en synaptische plaatsen in verschillende embryonale stadia, van 2 tot 12 dagen na elektroporatie. Op basis van deze methode, we bestempeld als de dorsale-grootste subgroep van hindbrain interneuronen (dA1/Atoh1 + </sup> cellen) en onthulde twee contralaterale opgaande axonale projectie patronen, elk afkomstig uit een andere AP locatie en verlengt in een aparte funiculus. DA1 axonen bleken project en nieuwe synapsen vormen in de auditieve kernen, middenhersenen en in meerdere lagen van de kleine hersenen 10.
De combinatie van kuiken elektroporatie, genetische traceren van neuronen en analyse van projectie gebieden op veel geavanceerde stadia van ontwikkeling vormt een uniek platform om de vorming van neuronale netwerken in de hersenen te bestuderen en moleculaire mechanismen die de vorming circuit regelen helderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In ovo elektroporatie is een haalbaar, betrouwbaar en doeltreffend instrument om celspecificatie en axonale begeleiding te onderzoeken tijdens chick ontwikkeling van het zenuwstelsel 20. In dit protocol beschrijven we een wijze van elektroporatie in het kuiken hindbrain op E2.75 met enhancer elementen die de voorwaardelijke etikettering van specifieke interneuronen mogelijk. Deze strategie wordt gecombineerd met de piggyBac gemedieerde omzetting systeem om vreemde genen in te voegen in het kuiken gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
