Civciv Embriyo aksonal Yörüngeler ve Synaptic Hedefler Trace için Beyin elektroporasyon
Summary
Gelişimsel nörobiyoloji temel bir soru nasıl nöron ağları embriyonik beyinde kurulan olmasıdır. Burada bu Cre / Lox-plazmid ve dorsal internöronlar etiket ve çeşitli gelişim aşamalarında kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri izlemek için kuş Beyin içinde piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi olarak yeni genetik araçları ile bir elektroporasyon tekniği kombine.
Abstract
Piliç embriyonik nöral tüpün elektroporasyon gibi nöronal hücrelerde yabancı genlerin sentezlenmesi için hızlı ve verimli olması gibi birçok avantajı vardır. Bu yazıda biz, özel olarak nöronal ataları bir alt etiket için E2.75 de kuş Beyin içine DNA electroporate nasıl benzersiz gösteriyor yöntemi ve ne gelişme çok ileri evrelerde kendi aksonal projeksiyonlar ve sinaptik hedefleri takip etmek sağlamak kadar E14.5 için. Tabanlı plazmid ve arka beyin hücreleri (internöronlar, dA1 dorsal en alt grubu) bir alt GFP ifade sürücü piggyBac-aracılı DNA aktarılması sistemi – Biz özel resim geliştirme elemanları, Cre / Lox dahil olmak üzere yeni genetik araçları kullanmış olurlar. Aksonal yörüngeleri ve dA1 akson hedefleri çeşitli beyin bölgelerinde erken ve geç embriyonik aşamalarında takip edilmektedir. Bu strateji embriyonik Beyin ilgi hücreleri hedef için ve tra için gelişmiş teknikler katkıdagelişim çeşitli aşamalarında devre oluşumu dans ediyorum.
Introduction
Beyin artan ve nöron ağları inen ile merkezi ve periferik sinir sistemi arasındaki iletişim kurarak sinir sisteminin önemli bir röle merkezi temsil eder. Bu solunum, bilinç, işitme ve motor koordinasyon 1-3 gibi temel fonksiyonlarını düzenler. Erken embriyonik gelişimi sırasında, omurgalı Beyin geçici farklı nöronal hücre tipleri oluşan ve çoklu beyin sapı çekirdekleri merkezleri 4 oluşturmak olduğu tekrarlayan rhombomeres, içine ön-arka (AP) ekseni boyunca bölünmüştür. Beyin de ayrık nöronal ataları belirtilen olmak ve farklı DV yerlerde 3,5,6 ayırt hangi bir bazal ve alar plaka, içine dorsal-ventral (DV) ekseni boyunca ayrılmıştır. Erken AP ve DV özel nöronal modelleri fonksiyonel beyin devrelerin kurulması yöneten nasıl büyük ölçüde bilinmemektedir.
Bu temel üzerinde bilgi sahibi olmaksoru, araçları erken Beyin nöronların belirli alt etiketlemek için ve daha ileri aşamalarında kendi aksonal yörüngeleri ve bağlantı takip etmek için gereklidir. Daha önce özel resim geliştirme elemanları kullanılan ve erken civciv embriyo 7-9 dorsal spinal internöron aksonal yörünge takip etmek için Cre / LoxP tabanlı koşullu ifade sistemi var. Mevcut yazıda; Beyin hedef ve değiştirilmiş bir elektroporasyon stratejisi ve piggyBac kullanarak, geç embriyonik arka beyin internöronlar, akson ve sinaptik hedefleri etiketleme için deneysel paradigma yükseltilmiş – aracılı DNA aktarılması. Yeni strateji 2 en fazla 12 gün arka beyin ve aksonal projeksiyonlar ve çeşitli embriyonik aşamalarında sinaptik sitelerin takibi bir tarafında belirgin nöronal alt tiplerinin etiketleme, elektroporasyon takip sağlar. Bu yöntem dayanarak, arka beyin internöronlar dorsal-en alt (dA1/Atoh1 + etiketli </skadar> hücreleri) ve iki taraf artan aksonal projeksiyon modelleri ortaya, her bir ayrı kordon farklı bir AP konumu ve uzar kaynaklanmaktadır. dA1 akson proje ve işitsel çekirdekleri, orta beyin ve beyincik 10 çok katmanlı form sinaps bulunmuştur.
Civciv elektroporasyon kombinasyonu, genetik nöronlar ve gelişme çok daha ileri aşamalarında projeksiyon sitelerinin analiz izleme beyindeki nöronal ağların oluşması ile çalışma ve devre oluşumunu düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için benzersiz bir platform sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovo elektroporasyon civciv sinir sistemi gelişimi 20 sırasında hücre özellikleri ve aksonal rehberlik incelemek için uygun bir, güvenilir ve etkili bir araçtır. Bu protokolde özel internöronlar koşullu etiketlenmesini sağlayan güçlendirici elemanlar kullanarak E2.75 de civciv Beyin içinde elektroporasyon bir modunu tanımlamak. Bu strateji embriyogenez ileri aşamalarında aksonal yolları, projeksiyonlar ve sinaptik siteleri izleme sağlayan civciv genom, yabancı genlerin eklemek i?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
