Electroporation من الدماغ المؤخر لتتبع مسارات محور عصبي والأهداف متشابك في الجنين الفرخ
Summary
كيف يتم إنشاء شبكات الخلايا العصبية في الدماغ الجنينية هي المسألة الأساسية في علم الأعصاب التنموي. هنا نحن الجمع بين تقنية electroporation مع الأدوات الوراثية الرواية، مثل لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن، البلازميدات وPiggyBac بوساطة نظام تبديل الحمض النووي في الدماغ المؤخر الطيور لتسمية interneurons الظهرية وتتبع التوقعات محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل النمو المختلفة.
Abstract
Electroporation من الفرخ الجنينية الأنبوب العصبي لديه العديد من المزايا مثل أن تكون سريعة وفعالة للتعبير عن الجينات الغريبة إلى خلايا العصبية. في هذا المخطوط ونحن نقدم الأسلوب الذي يوضح كيف فريد ل electroporate DNA في الدماغ المؤخر الطيور في E2.75 من أجل تسمية على وجه التحديد مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الأسلاف، وكيفية متابعة اسقاطاتها محور عصبي والأهداف متشابك في مراحل متقدمة بكثير من التنمية، حتى E14.5. لقد استخدمت الأدوات الوراثية الرواية بما في ذلك عناصر محددة محسن، لجنة المساواة العرقية / السلمون المدخن – البلازميدات مقرها ونظام تبديل الحمض النووي PiggyBac بوساطة لدفع التعبير GFP في نوع فرعي من خلايا الدماغ المؤخر (الظهرية معظم فرعية من interneurons، DA1). يتم اتباع مسارات وأهداف DA1 المحاور محور عصبي في المراحل الجنينية المبكرة والمتأخرة في مناطق الدماغ المختلفة. تساهم هذه الاستراتيجية التقنيات المتقدمة لاستهداف خلايا من الفائدة في الدماغ المؤخر الجنينية ولهيئة تنظيم الاتصالاتالوراثة تشكيل الدوائر في مراحل متعددة من التنمية.
Introduction
الدماغ المؤخر يمثل محور التتابع مفتاح في الجهاز العصبي من خلال التواصل بين الجهاز العصبي المركزي والمحيطي عبر الصعود والنزول الشبكات العصبية. وينظم الوظائف الأساسية بما في ذلك التنفس، والوعي، والسمع، والحركية التنسيق 1-3. أثناء التطور الجنيني المبكر، وينقسم الدماغ المؤخر الفقاريات عابر على طول لها الأمامي الخلفي (AP) في محور rhombomeres المتكررة، التي تتشكل أنواع الخلايا العصبية متميزة ومتعددة المراكز توليد نوى الدماغ 4. وينقسم الدماغ المؤخر أيضا جنبا إلى جنب في الظهري البطني (DV) محور في لوحة القاعدية والجناحية، الذي الأسلاف العصبية المنفصلة تصبح المحدد وتفرق في مواقع متميزة DV 3،5،6. كيف أوائل AP وDV-محددة أنماط الخلايا العصبية هي التي تنظم إنشاء circuitries الدماغ وظيفية غير معروف إلى حد كبير.
لاكتساب المعرفة الأساسية في هذاالسؤال، هناك حاجة إلى أدوات من أجل تسمية مجموعات فرعية معينة من الخلايا العصبية في الدماغ المؤخر المبكر وتتبع مساراتها محور عصبي والاتصال في مراحل أكثر تقدما. لقد استخدمت سابقا محسن عناصر محددة، ونظام التعبير الشرطي لجنة المساواة العرقية / المستندة إلى LoxP لتتبع مسار محور عصبي من interneurons العمود الفقري الظهري في جنين الفرخ المبكر 7-9. في المخطوطة الحالية قمنا استهدفت الدماغ المؤخر وترقية النموذج التجريبي لوصفها في وقت متأخر interneurons الدماغ المؤخر الجنينية، محاور عصبية وأهدافهم متشابك، وذلك باستخدام استراتيجية electroporation تعديل وPiggyBac – تبديل الحمض النووي بوساطة. يسمح لدينا استراتيجية جديدة لوضع علامات على أنواع فرعية متميزة العصبية في جانب واحد من الدماغ المؤخر وتتبع اسقاطاتها محور عصبي ومواقع متشابك في مختلف المراحل الجنينية، في الفترة من 2 إلى 12 يوما التالية electroporation. وبناء على هذه الطريقة، ونحن وصفت الظهري معظم فرعية من interneurons الدماغ المؤخر (dA1/Atoh1 + </sتصل> الخلايا) وكشفت اثنين المقابل تصاعدي أنماط الإسقاط محور عصبي، كل يستمد من موقع AP مختلفة، ويستطيل في الحبلة متميزة. تم العثور على DA1 محاور عصبية إلى المشروع ونقاط الاشتباك العصبي في شكل السمعية نوى، والدماغ المتوسط في طبقات متعددة من المخيخ 10.
مزيج من فرخ electroporation، تتبع الوراثية من الخلايا العصبية وتحليل مواقع الإسقاط في مراحل متقدمة بكثير من التنمية توفر منصة فريدة لدراسة تشكيل شبكات الخلايا العصبية في الدماغ وإلى توضيح الآليات الجزيئية التي تتحكم في تشكيل الدوائر.
Protocol
Representative Results
Discussion
electroporation في البيضة هو أداة مجدية وموثوقة، وفعالة لفحص مواصفات الخلية والتوجيه محور عصبي خلال كتكوت تطوير الجهاز العصبي 20. في هذا البروتوكول ونحن تصف طريقة electroporation في الدماغ المؤخر فرخ في E2.75 باستخدام عناصر محسن التي تمكن من وضع العلامات الشرطية interneurons محد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
