Electroporation av hindbrain å spore Aksonal Trajectories og Synaptic Targets i Chick Embryo
Summary
Hvordan nevrale nettverk er etablert i den embryonale hjernen er et grunnleggende spørsmål i utviklingspsykologi nevrobiologi. Her har vi kombinert en electroporation teknikken med romanen genetiske verktøy, for eksempel Cre / Lox-plasmider og PiggyBac-mediert DNA transposition system i luftfarten hindbrain å merke rygg interneurons og spore sine aksonale anslag og synaptiske mål på ulike utviklingsstadier.
Abstract
Electroporation av chick embryonale nevralrøret har mange fordeler som å være rask og effektiv for uttrykket av fremmede gener inn i nerveceller. I dette manuskriptet gir vi en metode som demonstrerer unikt hvordan du electroporate DNA inn i aviær hindbrain på E2.75 for å spesifikt merke en undergruppe av nevrale stamceller, og hvordan å følge sine aksonale anslag og synaptiske mål på mye avanserte stadier av utvikling, opp til E14.5. Vi har utnyttet nye genetiske verktøy, inkludert spesifikke enhancer elementer, Cre / Lox – baserte plasmider og PiggyBac-mediert DNA transposition system for å drive GFP uttrykk i en undertype av hindbrain celler (dorsal mest undergruppe av interneurons, da1). Aksonale baner og mål av da1 axoner følges ved tidlige og sene embryonale stadier på ulike hjernestammen regioner. Denne strategien bidrar avanserte teknikker for målretting celler av interesse i den embryonale hindbrain og for traprosjektfinansiering krets formasjon på flere stadier av utviklingen.
Introduction
Hindbrain representerer en viktig stafett hub av nervesystemet ved å kommunisere mellom de sentrale og perifere nervesystemet via stigende og synkende nevrale nettverk. Den regulerer grunnleggende funksjoner inkludert respirasjon, bevissthet, hørsel og motorisk koordinasjon 1-3. Under tidlig embryonal utvikling, er virveldyr hindbrain forbigående delt langs anterior-posterior (AP)-aksen i repeterende rhombomeres, der forskjellige nevrale celletyper er dannet og generere flere hjernestammen atomkjerner sentre fire. Hindbrain er også delt langs dorsal-ventral (DV)-aksen i en basal og Alar plate, hvor diskrete nevrale stamceller blir spesifisert og differensiere i forskjellige DV steder 3,5,6. Hvor tidlig AP og DV-spesifikke nevrale mønstre er styrende etablering av funksjonelle hjernestammen circuitries er i stor grad ukjent.
Å få kunnskap om dette grunnleggendespørsmål, er verktøy som kreves for å merke spesifikke undergrupper av nevroner i tidlig hindbrain og for å oppspore sine aksonale baner og tilkoblingsmuligheter på mer avanserte stadier. Vi har tidligere benyttet spesifikke enhancer elementer, og en Cre / LoxP-baserte betinget uttrykk system for sporing aksonal banen dorsal spinal interneurons tidlig chick embryo 7-9. I dagens manuskriptet har vi målrettet hindbrain og oppgradert den eksperimentelle paradigmet for merking sene embryonale hindbrain interneurons, aksoner og deres synaptiske mål, ved hjelp av en modifisert electroporation strategi og PiggyBac – mediert DNA innarbeiding. Vår nye strategi tillater merking av forskjellige nevrale subtyper i den ene siden av hindbrain og sporing av sine aksonale anslag og synaptiske områder på ulike embryonale stadier, fra 2 opp til 12 dager etter electroporation. Basert på denne metoden, merket vi dorsal-mest undergruppe av hindbrain interneurons (dA1/Atoh1 + </sopp> celler) og avdekket to kontralaterale stigende aksonale projeksjon mønstre, kommer hver fra en annen AP plassering og elongates i en distinkt funiculus. DA1 axoner ble funnet i prosjektet og danner synapser i det auditive kjerner, midthjernen og i flere lag av lillehjernen 10.
Kombinasjonen av chick elektroporering, genetisk sporing av nevroner og analyse av projeksjon nettsteder på mye avanserte stadier av utvikling gir en unik plattform for å studere dannelsen av nevrale nettverk i hjernen og å belyse molekylære mekanismer som styrer kretsen formasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
I ovo electroporation er et mulig, pålitelig og effektivt verktøy for å undersøke celle spesifikasjon og aksonal veiledning under chick nervesystemet utvikling 20. I denne protokollen beskriver vi en modus for elektroporering i chick hindbrain på E2.75 hjelp enhancer elementer som gjør den betingede merking av bestemte interneurons. Denne strategien er kombinert med PiggyBac-mediert innarbeiding system for å sette inn fremmede gener inn i chick genomet, som muliggjør sporing av aksonale ruter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
