Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo
Summary
Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.
Abstract
Elettroporazione del pulcino embrionale tubo neurale ha molti vantaggi come essere veloce ed efficiente per l'espressione di geni estranei in cellule neuronali. In questo manoscritto forniamo un metodo che dimostra univocamente come l'elettroporazione di DNA nel cervello posteriore aviaria in E2.75, al fine di etichettare specificamente un sottoinsieme di progenitori neuronali, e come seguire le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche in Gran fase avanzata di sviluppo, fino a E14.5. Abbiamo utilizzato nuovi strumenti genetici tra cui specifici elementi enhancer, Cre / Lox – plasmidi base e il sistema di recepimento DNA PiggyBac-mediata di guidare l'espressione della GFP in un sottotipo di cellule romboencefalo (la dorsale più sottogruppo di interneuroni, DA1). Traiettorie e target di DA1 assoni assonale sono seguiti a inizio e fine fasi embrionali in varie regioni del tronco encefalico. Questa strategia contribuisce tecniche avanzate per il targeting di cellule di interesse nel romboencefalo embrionale e per il TRACing formazione circuito a più stadi di sviluppo.
Introduction
Romboencefalo rappresenta un mozzo relè chiave del sistema nervoso comunicando tra il sistema nervoso centrale e periferico tramite ascendente e discendente reti neuronali. Esso regola le funzioni di base tra cui la respirazione, la coscienza, l'udito, e la coordinazione motoria 1-3. Durante lo sviluppo embrionale precoce, la romboencefalo vertebrati viene transitoriamente suddiviso lungo il suo asse antero-posteriore (AP) in rhombomeres ripetitivi, in cui si formano diversi tipi di cellule neuronali e generano molteplici centri nuclei del tronco cerebrale 4. Il cervello posteriore è diviso lungo il suo asse dorso-ventrale (DV) in una piastra basale e alari, in cui progenitori neuronali discrete diventano specificati e differenziano in distinti luoghi DV 3,5,6. Come il primo AP e specifiche DV modelli neuronali sono di istituzione dei circuiterie tronco cerebrale funzionale è in gran parte sconosciuto.
Di acquisire conoscenze su questo fondamentalequestione, gli strumenti sono necessari al fine di etichettare specifici sottoinsiemi di neuroni nel cervello posteriore e presto per tracciarne la traiettoria degli assoni e la connettività nelle fasi più avanzate. Abbiamo precedentemente utilizzati specifici elementi enhancer, e un sistema di espressione condizionale Cre / loxP-based per il monitoraggio traiettoria assonale delle dorsali interneuroni spinali nei primi embrione di pollo 7-9. Nel manoscritto attuale abbiamo preso di mira il cervello posteriore e aggiornato il paradigma sperimentale per l'etichettatura di fine interneuroni romboencefalo embrionali, gli assoni e ai loro obiettivi sinaptici, utilizzando una strategia di elettroporazione modificato e il PiggyBac – trasposizione del DNA mediata. La nostra nuova strategia permette la codifica dei sottotipi neuronali distinti in un lato del cervello posteriore e il tracciamento delle loro proiezioni assonali e siti sinaptici nelle varie fasi embrionali, da 2 a 12 giorni dopo l'elettroporazione. In base a questo metodo, abbiamo etichettato la dorsale più a sottogruppo di interneuroni romboencefalo (dA1/Atoh1 + </sup> celle) e ha rivelato due controlaterale ascendenti modelli di proiezione assonale, ogni deriva da una posizione diversa AP e allunga in un funicolo distinto. sono stati trovati DA1 assoni al progetto e formano sinapsi nei nuclei uditivi, mesencefalo e in strati multipli del cervelletto 10.
La combinazione di pulcino elettroporazione, genetica rintracciamento di neuroni e analisi di siti per proiezioni molto stadi avanzati di sviluppo prevede una piattaforma unica per studiare la formazione di reti neuronali nel cervello e per chiarire i meccanismi molecolari che presiedono circuito.
Protocol
Representative Results
Discussion
In elettroporazione ovo è uno strumento fattibile, affidabile ed efficace per esaminare le specifiche delle cellule e la guida assonale durante pulcino sviluppo del sistema nervoso 20. In questo protocollo si descrive una modalità di elettroporazione in romboencefalo pulcino a E2.75 utilizzando elementi enhancer che consentano l'etichettatura condizionale di interneuroni specifici. Questa strategia è combinato con il sistema di recepimento PiggyBac-mediata di inserire geni estranei ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number |
| L-shaped gold Genetrodes 3 mm electrodes | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 |
| pulse generator, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 |
| OCT (Optimal Cutting Temperature) Compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 O.C.T. Compound |
| Nail Polish | From Any Commercial Supplier |
References
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y. Excitatory neurons of the proprioceptive, interoceptive, and arousal hindbrain networks share a developmental requirement for Math1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22462-22467 (2009).
- Storm, R., et al. The bHLH transcription factor Olig3 marks the dorsal neuroepithelium of the hindbrain and is essential for the development of brainstem nuclei. Development. 136, 295-305 (2009).
- Lumsden, A. The cellular basis of segmentation in the developing hindbrain. Trends Neurosci. 13, 329-335 (1990).
- Liu, Z., et al. Control of precerebellar neuron development by Olig3 bHLH transcription factor. J. Neurosci. 28, 10124-10133 (2008).
- Muller, T., et al. The bHLH factor Olig3 coordinates the specification of dorsal neurons in the spinal cord. Genes Dev. 19, 733-743 (2005).
- Avraham, O., et al. Motor and dorsal root ganglion axons serve as choice points for the ipsilateral turning of dI3 axons. J. Neurosci. 30, 15546-15557 (2010).
- Avraham, O., et al. Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1. Neural Dev. 4, 21 (2009).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), e1792 (2010).
- Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. Axonal Patterns and Targets of dA1 Interneurons in the Chick Hindbrain. J. Neurosci. 32, 5757-5771 (2012).
- Vogel, J., Mobius, C., Kuschinsky, W. Early delineation of ischemic tissue in rat brain cryosections by high-contrast staining. Stroke. 30, 1134-1141 (1999).
- Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development. 127, 1185-1196 (2000).
- Lumpkin, E. A., et al. Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice. Gene Expr. Patterns. 3, 389-395 (2003).
- Lu, Y., Lin, C., Wang, X. PiggyBac transgenic strategies in the developing chicken spinal cord. Nucleic Acids Res. 37, e141 (2009).
- Wang, J., et al. piggyBac-like elements in the pink bollworm, Pectinophora gossypiella. Insect Mol. Biol. 19, 177-184 (2010).
- Alsina, B., Vu, T., Cohen-Cory, S. Visualizing synapse formation in arborizing optic axons in vivo: dynamics and modulation by BDNF. Nat. Neurosci. 4, 1093-1101 (2001).
- Leal-Ortiz, S., et al. Piccolo modulation of Synapsin1a dynamics regulates synaptic vesicle exocytosis. J. Cell Biol. 181, 831-846 (2008).
- Gardzinski, P., et al. The role of synaptotagmin I C2A calcium-binding domain in synaptic vesicle clustering during synapse formation. J. Physiol. 581, 75-90 (2007).
- Nowack, A., Yao, J., Custer, K. L., Bajjalieh, S. M. SV2 regulates neurotransmitter release via multiple mechanisms. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299, C960-C967 (2010).
- Itasaki, N., Sharpe, J., Morrison, A., Krumlauf, R. Reprogramming Hox expression in the vertebrate hindbrain: influence of paraxial mesoderm and rhombomere transposition. Neuron. 16, 487-500 (1996).
- Clarke, J. D., Lumsden, A. Segmental repetition of neuronal phenotype sets in the chick embryo hindbrain. Development. 118, 151-162 (1993).
- Diaz, C., Glover, J. C., Puelles, L., Bjaalie, J. G. The relationship between hodological and cytoarchitectonic organization in the vestibular complex of the 11-day chicken embryo. J. Comp. Neurol. 457, 87-105 (2003).
- Marin, F., Puelles, L. Morphological fate of rhombomeres in quail/chick chimeras: a segmental analysis of hindbrain nuclei. Eur. J. Neurosci. 7, 1714-1738 (1995).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
