Quantification des propriétés mécaniques de la Glycocalyx endothéliale par microscopie à force atomique

Summary

Les caractéristiques mécaniques du glycocalyx endothéliale ont été mesurées par indentation à l'aide des sphères micrométriques sur des cantilevers AFM. Les cellules endothéliales ont été cultivées dans une chambre de mesure dans des conditions physiologiques de flux pour induire l'expression glycocalyx. Les données ont été analysées en utilisant un modèle de film mince pour déterminer l'épaisseur et le module glycocalyx.

Abstract

Notre compréhension de l'interaction des leucocytes et la paroi de la cuve lors de la capture des leucocytes est limitée par une compréhension incomplète des propriétés mécaniques de la couche de surface endothéliale. Il est connu que les molécules d'adhésion sur les leucocytes sont répartis non uniformément par rapport à la topographie de surface ^3, que la topographie limite la formation de liaison adhésive avec d'autres surfaces ^9, et que les forces de contact physiologiques (≈ 5,0 à 10,0 pN par microvillosités) permet de compresser les microvillosités comme moins un tiers de leur longueur au repos, ce qui augmente l'accessibilité des molécules à la surface opposée ^{3, 7.} On considère que l'endothélium d'une structure à deux couches, le corps de cellule relativement rigide, plus la glycocalyx, un enrobage de sucre souple de protection sur la surface luminale ^6. Il a été démontré que le glycocalyx peut agir comme une barrière pour réduire l'adhérence des leucocytes à l'endothélium ⁴ Surface.Dans ce rapport, nous commençons à aborder la déformabilité des surfaces endothéliales de comprendre comment la rigidité mécanique endothéliale pourrait affecter la formation de liaisons. Les cellules endothéliales en culture statique n'expriment pas un glycocalyx robuste, mais les cellules cultivées dans des conditions d'écoulement physiologiques commencent à approcher le glycocalyx observée in vivo ^2. Le module de l'organisme des cellules endothéliales a été mesurée par microscopie à force atomique (AFM) à environ 5 à 20 kPa ^5. L'épaisseur et la structure du glycocalyx ont été étudiés en microscopie électronique à ^8, et le module du glycocalyx a été estimés à l'aide des méthodes indirectes, mais à notre connaissance, il n'y a pas eu de rapports publiés par une mesure directe du module glycocalyx des cellules vivantes . Dans cette étude, nous présentons des expériences faites avec indentation une nouvelle sonde AFM sur des cellules qui ont été cultivées dans des conditions de maximiser leur expression glycocalyx à mamesures directes de la ke module et de l'épaisseur de la glycocalyx endothéliale.

Protocol

1. Méthodes 1.1 Chambre débit cellulaire Une chambre d'écoulement, illustré à la figure 1, a été construit de telle sorte que les cellules peuvent être cultivées sous un cisaillement de 1,0 Pa (10 dynes / cm 2), puis transféré directement à un asile MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). La chambre de circulation a été préparé pour l'expérience d'abord nettoyer les lames de verre dans une solution piranha (…

Representative Results

Dans une expérience typique, 20 force vs distance courbes ont été obtenues à partir d'une région donnée de la cellule, généralement dans la région périnucléaire, à proximité, mais pas sur le noyau (dans ~ 2 um). Les courbes ont été alignés pour tenir compte de toute dérive échantillon au cours de la durée de la mesure, puis la moyenne pour éliminer le bruit en porte à faux, comme le montre la figure 4. Les courbes ont été analysés et qui cadrent avec le modèle à deux couche…

Discussion

Nous avons utilisé les valeurs calculées à partir du modèle à deux couches et la théorie de Hertz pour modéliser l'interaction d'un leucocyte circulant dans le sang avec la paroi endothéliale. Nous avons calculé qu'une microvillosités sur les leucocytes d'un diamètre de 50 nm sous une charge de 10 pN aurait tiret environ 150 nm dans le glycocalyx, seule une fraction de l'épaisseur totale. Ceci indique que le glycocalyx, avec des propriétés telles que mesurées dans cette expérience, es…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
McCoy’s Medium	Gibco	16600-082
Fetal Calf Serum	Hyclone	SH30070
Endothelial Cell Growth Medium	Vec Technologies	MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells	Vec Technologies	PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid	JT Baker	9681-02
Hydrogen Peroxide	VWR	BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane	Aldrich	440140-100ML
Isopropyl Alcohol	VWR	BDH8999-4
Trypsin	Cellgro	25-054-C1
Hank’s Buffered Salt Solution	Gibco	14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335
Streptavadin beads	Dynabeads	112.06D
MFP-3D AFM	Asylum Research
Tipless Cantilevers	Nanoworld	ARROW-TL1-50
Silhouette SD	Quickutz	Silhouette-SD
Silicone Rubber	Stockwell Elastomerics	SE50-RS
30 ml Syringes	Benton Dickinson	309650
18 gauge needles	Benton Dickinson	305196
Extension Sets	Hospira	4429-48
4 way valves	Teleflex	W21372
Male/Female Port Caps	Smith’s Medical	MX491B
Peristaltic Pump	Watson-Marlow	401U/D
Peristaltic Tubing	Watson-Marlow	903.0016.016
sterile filters	Pall Life Science	4652