Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Endotelyal Glycocalyx Mekanik Özelliklerinin nicel
Summary
Endotel glycocalyx mekanik özellikleri AFM konsollar üzerine mikron boyutlu küreler kullanarak girinti ile ölçüldü. Endotel hücreleri glycocalyx ifadesi neden fizyolojik akış koşullarında özel bir odasında kültüre edildi. Veri glycocalyx kalınlık ve modül belirlemek için, ince bir film model kullanılarak analiz edildi.
Abstract
Lökositler ve lökosit çekme sırasında damar duvarının etkileşimin anlaşılmasına endotel yüzey tabakasının mekanik özellikleri eksik bir anlayış ile sınırlıdır. Bu lökosit adezyon moleküllerinin yüzey topografyası 3 göreli olmayan düzgün yayılı olduğu bilinmektedir, bu topografya diğer yüzeyleri 9 yapışkan bağ oluşumu sınırlar ve fizyolojik temas kuvvetleri (≈ 5,0 – mikrovillus başına 10.0 pN) olarak mikrovilluslar sıkıştırabilir karşıt yüzeyi 3, 7 ila moleküllerin yönelik artan istirahat uzunluğunun üçte biri kadar biraz. Bir iki-tabakalı yapı, nispeten sert hücre gövdesi, artı glycocalyx, lümen yüzeyi 6 üzerinde bir koruyucu yumuşak bir şeker kaplama gibi endotelyum düşünün. Bu glycocalyx endotel yüzeyi 4 lökositlerin yapışmasını azaltmak için bir engel olarak hareket edebilir olduğu gösterilmiştir.Bu yazıda endotel mekanik sertliği bağ oluşumu nasıl etkileyeceğini anlamak için endotel yüzeyler deformabilitesi ele başlar. Statik kültüründe yetişen Endotel hücreleri sağlam glycocalyx ifade etmezler, ancak fizyolojik akış koşullarında yetiştirilen hücreler in vivo 2 gözlenen yaklaşık glycocalyx başlar. Endotel hücre vücudun modülü yaklaşık 5 ila 20 kPa 5 olmak atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanılarak ölçülmüştür. Glycocalyx kalınlığı ve yapısı elektron mikroskobu 8 kullanılarak çalışılmıştır ve glycocalyx bir modülü dolaylı yöntemler kullanılarak yaklaştırılır olmuştur, ama bildiğimiz kadarıyla, canlı hücreler içerisinde glycocalyx modülü doğrudan ölçüm yayımlanmış bir rapor olmamıştır . Bu çalışmada, biz ma kendi glycocalyx ifade maksimize etmek koşullarda kültüre edilmiştir hücreleri üzerine bir roman AFM probe ile yapılan girinti deneyler sunmakendotel glycocalyx bir modülü ve kalınlığı ke doğrudan ölçümler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iki tabaka modeli ve endotel duvar ile kan içinde dolaşan bir lökosit etkileşimini modellemek için Hertz teori hesaplanan değerler kullanılmıştır. Biz, 10 pN yük altında 50 nm çapında lökosit bir mikrovillus glycocalyx içine yaklaşık 150 nm girinti edeceğini toplam kalınlığı yalnızca bir kısmını hesaplanmıştır. Bu, bu deneyde ölçüldüğü gibi özelliklere sahip glycocalyx, hücre-hücre etkileşim için önemli bir engel olan ve lökosit hücre yapışma sırasında yapışma sıras?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu proje ile birlikte yardım için Elena Lomakina, Richard Bauserman, Margaret Youngman, Shay Vaknin, Jessica Snyder, Chris Striemer, Nakul Nataraj, Hung Li Chung, Tejas Khire, ve Eric Lam teşekkür etmek istiyorum. Bu proje NIH # PO1 HL 018208 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s Medium | Gibco | 16600-082 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | SH30070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| Sulfuric Acid | JT Baker | 9681-02 | |
| Hydrogen Peroxide | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Aldrich | 440140-100ML | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | BDH8999-4 | |
| Trypsin | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| Streptavadin beads | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | Asylum Research | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD | Quickutz | Silhouette-SD | |
| Silicone Rubber | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml Syringes | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18 gauge needles | Benton Dickinson | 305196 | |
| Extension Sets | Hospira | 4429-48 | |
| 4 way valves | Teleflex | W21372 | |
| Male/Female Port Caps | Smith’s Medical | MX491B | |
| Peristaltic Pump | Watson-Marlow | 401U/D | |
| Peristaltic Tubing | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| sterile filters | Pall Life Science | 4652 |
References
- Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young’s modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson’s ratios. Nanotechnology. , (2009).
- Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).
- Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm. Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).
- Lipowski, H. H. The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases. Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).
- Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. Mechanical properties of actin stress fibers in living cells. Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).
- vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema. Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).
- Vink, H., Duling, B. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circulation Research. 79, 581-589 (1996).
