Summary

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Published: February 21, 2013
doi:

Summary

Las características mecánicas de glicocálix endotelial se midieron por indentación usando esferas micrón en voladizo de AFM. Las células endoteliales se cultivaron en una cámara de costumbre bajo condiciones de flujo fisiológico para inducir la expresión glicocálix. Los datos se analizaron utilizando un modelo de película delgada para determinar el espesor y el módulo de glicocálix.

Abstract

Nuestro entendimiento de la interacción de los leucocitos y la pared del vaso durante la captura de leucocitos está limitado por una comprensión incompleta de las propiedades mecánicas de la capa de la superficie endotelial. Se sabe que las moléculas de adhesión en los leucocitos se distribuyen de manera no uniforme en relación con topografía de la superficie 3, que limita la formación de topografía unión adhesiva con otras superficies 9, y que las fuerzas de contacto fisiológicas (≈ 5,0 a 10,0 pN por microvellosidades) puede comprimir las microvellosidades como poco como un tercio de su longitud en reposo, el aumento de la accesibilidad de las moléculas a la superficie opuesta 3, 7. Consideramos el endotelio como una estructura de dos capas, el cuerpo celular relativamente rígido, además de la glucocáliz, un recubrimiento de azúcar blando protectora en la superficie luminal 6. Se ha demostrado que el glicocáliz puede actuar como una barrera para reducir la adhesión de los leucocitos a la superficie endotelial 4.En este informe se empiezan a abordar la deformabilidad de las superficies endoteliales para entender cómo la rigidez mecánica del endotelio puede afectar la formación del enlace. Las células endoteliales cultivadas en cultivo estático no expresan un glicocalix robusta, pero las células cultivadas bajo condiciones de flujo fisiológico comienzan a aproximar el glucocáliz observado in vivo 2. El módulo del cuerpo de células endoteliales ha sido medida mediante microscopía de fuerza atómica (AFM) para ser aproximadamente de 5 a 20 kPa 5. El espesor y la estructura del glicocálix se han estudiado utilizando microscopía electrónica de 8, y el módulo de la glicocálix se ha aproximado mediante métodos indirectos, pero a nuestro conocimiento, no se han publicado informes de una medición directa del módulo glicocálix en células vivas . En este estudio, se presentan experimentos de indentación realizadas con una sonda AFM novela en células que han sido cultivadas en condiciones para maximizar su expresión glicocálix a make mediciones directas del módulo y el espesor de la glicocálix endotelial.

Protocol

1. Métodos 1,1 Celular Cámara de Flujo Una cámara de flujo, que se muestra en la Figura 1, fue construido de manera que las células pueden ser cultivadas bajo un esfuerzo cortante de 1,0 Pa (10 dinas / cm 2) y luego se transfiere directamente a un asilo MFP3D AFM (Santa Barbara, CA). La cámara de flujo se preparó para el experimento por primera limpieza de los portaobjetos de vidrio en solución Piranha (3:1 H 2</sub…

Representative Results

En un experimento típico, 20 fuerza-distancia-vs curvas se obtuvieron a partir de una región determinada de la célula, típicamente en la región perinuclear, cerca, pero no en, el núcleo (a menos de ~ 2 micras). Las curvas se ajustaron para tener en cuenta cualquier deriva de la muestra durante toda la duración de la medición y se promediaron para eliminar el ruido en voladizo, como se muestra en la Figura 4. Las curvas se analizaron y encajar con el modelo de dos capas que fue desarrollado para …

Discussion

Se utilizaron los valores calculados a partir del modelo de dos capas y la teoría de Hertz para modelar la interacción de un leucocito circulante en la sangre con la pared endotelial. Hemos calculado que un microvellosidades en el recuento de leucocitos con un diámetro de 50 nm bajo una carga de 10 pN guión sería de aproximadamente 150 nm en el glucocáliz, sólo una fracción del espesor total. Esto indica que el glucocáliz, con propiedades como medidos en este experimento, es una barrera significativa para la in…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean dar las gracias a Elena Lomakina, Bauserman Richard Youngman Margaret, Vaknin Shay, Snyder Jessica, Striemer Chris, Nataraj Nakul, Hung Li Chung, Khire Tejas, y Eric Lam por su ayuda en este proyecto. Este proyecto fue financiado por el NIH PO1 HL # 018208.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
McCoy’s Medium Gibco 16600-082
Fetal Calf Serum Hyclone SH30070
Endothelial Cell Growth Medium Vec Technologies MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells Vec Technologies PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid JT Baker 9681-02
Hydrogen Peroxide VWR BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane Aldrich 440140-100ML
Isopropyl Alcohol VWR BDH8999-4
Trypsin Cellgro 25-054-C1
Hank’s Buffered Salt Solution Gibco 14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
Streptavadin beads Dynabeads 112.06D
MFP-3D AFM Asylum Research
Tipless Cantilevers Nanoworld ARROW-TL1-50
Silhouette SD Quickutz Silhouette-SD
Silicone Rubber Stockwell Elastomerics SE50-RS
30 ml Syringes Benton Dickinson 309650
18 gauge needles Benton Dickinson 305196
Extension Sets Hospira 4429-48
4 way valves Teleflex W21372
Male/Female Port Caps Smith’s Medical MX491B
Peristaltic Pump Watson-Marlow 401U/D
Peristaltic Tubing Watson-Marlow 903.0016.016
sterile filters Pall Life Science 4652

References

  1. Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young’s modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson’s ratios. Nanotechnology. , (2009).
  2. Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).
  3. Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm. Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).
  4. Lipowski, H. H. The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases. Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).
  5. Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. Mechanical properties of actin stress fibers in living cells. Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).
  6. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).
  7. Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).
  8. vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema. Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).
  9. Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).
  10. Vink, H., Duling, B. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circulation Research. 79, 581-589 (1996).
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Cite This Article
Marsh, G., Waugh, R. E. Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (72), e50163, doi:10.3791/50163 (2013).

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