Количественная Механические свойства эндотелиальных гликокаликса с атомно-силовой микроскопии
Summary
Механические свойства эндотелиальных гликокаликса были измерены отступ использованием микронных размеров сферы на консоли АСМ. Эндотелиальные клетки культивировали в пользовательской камеры в физиологических условиях потока, чтобы вызвать гликокаликса выражение. Данные были проанализированы с помощью тонкой моделью фильм для определения толщины и гликокаликса модуля.
Abstract
Наше понимание взаимодействия лейкоцитов и стенки сосуда во время захвата лейкоцитов ограничен неполное понимание механических свойств эндотелия поверхностного слоя. Известно, что молекулы адгезии на лейкоцитах распределены неравномерно по отношению к топографии поверхности 3, рельеф ограничивает клей формирование связей с другими поверхностями 9, и что физиологические силы контакта (≈ 5,0 – 10,0 пН в микроворсинок) может сжимать микроворсинки как лишь треть их длины покоя, повышение доступности молекул на противоположной поверхности 3, 7. Рассмотрим, как эндотелий двухслойной структурой, относительно жесткой тела клетки, а также гликокаликса, мягкий защитный слой сахара на просвет поверхность 6. Было показано, что гликокаликса может выступать в качестве барьера для уменьшения адгезии лейкоцитов к эндотелиальной поверхности 4.В этом докладе мы приступить к решению деформируемость поверхности эндотелиальных понять, как эндотелиальные механическая жесткость может повлиять на образовании связи. Эндотелиальных клеток, выращенных в культуре статического не выражают надежные гликокаликса, но клетки, выращенные в физиологических условиях потока начинают приближенных гликокаликса наблюдается в естественных условиях 2. Модуль эндотелиальные клетки тела были измерены с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) составляет примерно от 5 до 20 кПа 5. Толщина и структура гликокаликса были изучены с помощью электронного микроскопа 8 и модуль гликокаликса были аппроксимированы с использованием косвенных методов, но насколько нам известно, не было никаких опубликованных отчетов прямого измерения модуля гликокаликса в живых клетках . В этом исследовании мы представляем отступ эксперименты с новым АСМ зонда на клетки, которые культивировались в условиях максимизировать свои гликокаликса выражение маке прямые измерения модуля упругости и толщины эндотелиального гликокаликса.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали значения, вычисленные из двухслойной модели и теории Герца для моделирования взаимодействия лейкоцитов, циркулирующих в крови с эндотелиальной стенкой. Мы подсчитали, что микроворсинок на лейкоциты с диаметром 50 нм при нагрузке в 10 пН бы отступ около 150 нм в гликокалик?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Елена Ломакина, Ричард Баузерман, Маргарет Youngman, Шей Вакнин, Джессика Снайдер, Крис Striemer, Nakul Nataraj, Хун Ли Чунг, Tejas Khire, и Эрик Лам за их помощь в этом проекте. Этот проект был профинансирован NIH # PO1 HL 018208.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| McCoy’s Medium | Gibco | 16600-082 | |
| Fetal Calf Serum | Hyclone | SH30070 | |
| Endothelial Cell Growth Medium | Vec Technologies | MCDB-131 | |
| Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Vec Technologies | PHUVEC/T-25 | |
| Sulfuric Acid | JT Baker | 9681-02 | |
| Hydrogen Peroxide | VWR | BDH3742-1 | |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Aldrich | 440140-100ML | |
| Isopropyl Alcohol | VWR | BDH8999-4 | |
| Trypsin | Cellgro | 25-054-C1 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution | Gibco | 14175-095 | |
| sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | |
| Streptavadin beads | Dynabeads | 112.06D | |
| MFP-3D AFM | Asylum Research | ||
| Tipless Cantilevers | Nanoworld | ARROW-TL1-50 | |
| Silhouette SD | Quickutz | Silhouette-SD | |
| Silicone Rubber | Stockwell Elastomerics | SE50-RS | |
| 30 ml Syringes | Benton Dickinson | 309650 | |
| 18 gauge needles | Benton Dickinson | 305196 | |
| Extension Sets | Hospira | 4429-48 | |
| 4 way valves | Teleflex | W21372 | |
| Male/Female Port Caps | Smith’s Medical | MX491B | |
| Peristaltic Pump | Watson-Marlow | 401U/D | |
| Peristaltic Tubing | Watson-Marlow | 903.0016.016 | |
| sterile filters | Pall Life Science | 4652 |
References
- Clifford, C., Seah, M. Nanoindentation measurement of young’s modulus for compliant layers on stiffer substrates including the effect of poisson’s ratios. Nanotechnology. , (2009).
- Gouverneur, M., Spaan, J. A. E., Pannekoek, H., Fontijn, R. D., Vink, H. Fluid shear stress stimulates incorporation of hyaluronan into endothelial cell glycocalyx. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 290 (1), 458-452 (2006).
- Hocde, S. A., Hyrien, O., Waugh, R. E. Cell adhesion molecule distribution relative to neutrophil surface topography assessed by tirfm. Biophysical Journal. 97 (1), 379-387 (2009).
- Lipowski, H. H. The endothelial glycocalyx as a barrier to leukocyte adhesion and its mediation by extracellular proteases. Annals of biomedical engineering. 40 (4), 840-848 (2012).
- Lu, L., Oswald, S. J., Ngu, H., Yin, F. C. P. Mechanical properties of actin stress fibers in living cells. Biophysical Journal. 95 (12), 6060-6071 (2008).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. The endothelial surface layer. Pflugers Archiv. European Journal of Physiology. 440 (5), 653-666 (2000).
- Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force. Biophysical Journal. 87 (6), 4237-4245 (2004).
- vanden Berg, B. M., Vink, H., Spaan, J. A. E. The endothelial glycocalyx protects against myocardial edema. Circulation Research. 92 (6), 592-594 (2003).
- Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity. J. Biol. Chem. 276 (16), 13283-138 (2001).
- Vink, H., Duling, B. Identification of Distinct Luminal Domains for Macromolecules, Erythrocytes, and Leukocytes Within Mammalian Capillaries. Circulation Research. 79, 581-589 (1996).
