Summary

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Published: February 21, 2013
doi:

Summary

내피 glycocalyx의 기계적 특성은 AFM의 cantilevers에 마이크론 크기의 영역을 사용하여 들여 쓰기에 의해 측정되었다. 내피 세포는 glycocalyx 식을 유도하기 위해 생리 흐름 조건에서 사용자 정의 챔버에 배양 하였다. 데이터는 glycocalyx 두께와 탄성 계수를 결정하기 위해 박막 모델을 사용 분석 하였다.

Abstract

백혈구 및 백혈구 캡처하는 동안 혈관 벽의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 내피 표면 층의 기계적 성질의 불완전한 이해에 의해 제한됩니다. 이것은 백혈구의 접착 분자가 표면 지형 3 상대적으로 비 균일하게 분포되어 알려져 있습니다, 그 지형이 다른 표면 9 접착제 결합 형성을 제한, 그 생리 접촉 힘 (≈ 5.0 – microvillus 당 10.0 PN)는 등으로 microvilli을 압축 할 수 있습니다 반대 표면 3, 7 분자의 접근성을 증가 자신의 휴식 길이의 세 번째로 조금. 우리는 두 계층 구조, 상대적으로 강성 전지 본체뿐만 아니라 glycocalyx, luminal 표면 6 부드러운 보호 설탕 코팅으로 내피를 고려합니다. 그것은 glycocalyx는 내피 표면 4 백혈구의 접착을 줄이기 위해 장벽의 역할을 할 수 것으로 나타되었습니다.이 보고서에서 우리는 내피 기계 강성이 결합 형성에 영향을 미칠 수 방법을 이해하기 위해 내피 표면의 deformability를 해결하기 시작합니다. 정적 문화에 성장 내피 세포는 강력한 glycocalyx을 표현할 수 없지만, 생리 흐름 조건에서 성장 세포가 생체 2 관찰 대략 glycocalyx에 시작한다. 내피 세포 본체의 계수는 약 5-20 kPa 5로 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 측정되었습니다. glycocalyx의 두께와 구조는 전자 현미경 8을 사용 연구되었으며, glycocalyx의 계수는 간접적 인 방법을 사용하여 추정되었지만, 우리의 지식으로, 살아있는 세포에 glycocalyx 계수의 직접 측정 대한 출판 보고서가 없었습니다 . 본 연구에서는, 우리는 mA 자신의 glycocalyx 표현을 극대화 할 조건에서 배양 된 세포에 새로운 AFM 프로브로 만든 들여 쓰기 실험을 제시내피 glycocalyx의 계수와 두께 KE 직접 측정.

Protocol

1. 방법 1.1 셀 흐름 상공 회의소 세포가 1.0 파 (10 dyn / cm 2)의 전단에 따라 성장 후 정신 병원 MFP3D AFM (산타 바바라, CA)에 직접 전달 될 ​​수 있도록 그림 1에 표시된 흐름 챔버는, 건설되었습니다. 15 분에 한 후 증류수로를 세척 : 흐름 챔버 먼저 피라냐 솔루션 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4) 유리 슬라이…

Representative Results

전형적인 실험에서, 20 힘 – 대 – 거리 곡선은 근처 있지만 핵 (~ 2 μm 이내)에, 일반적으로 perinuclear 지역에서, 세포의 특정 지역에서 얻었다. 곡선은 측정 기간 동안 모든 샘플 드리프트에 대한 계정에 정렬 한 후 그림 4에 도시 된 바와 같이, 캔틸레버 노이즈를 제거하는 평균했습니다. 곡선 분석하고 얇은 폴리머 필름 (1)의 계수와 두께를 결정하기 위해 개발되었습니다 두 개의…

Discussion

우리는 두 레이어 모델과 내피 벽에 혈액에 순환 백혈구의 상호 작용을 모델링 할 수 헤르츠 이론에서 계산 값을 사용했습니다. 우리는 10 PN 부하에 따라 50 nm의 직경이 백혈구에 microvillus가 glycocalyx에 약 150 nm의 들여 쓰기 것이라는 총 두께의 일부만 계산했습니다. 이이 실험에서 측정 된 특성을 가진 glycocalyx은, 세포 세포의 상호 작용에 중요한 장벽이며 세포가 백혈구 유착 동안 부착 캐스케이드…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는이 프로젝트와의 도움을 엘레나 Lomakina, 리처드 Bauserman, 마가렛 젊은, 셰이 Vaknin, 제시카 스나이더, 크리스 Striemer, Nakul Nataraj, 숙취 리 정, Tejas Khire, 그리고 에릭 램을 감사드립니다. 이 프로젝트는 NIH # PO1 HL 018,208로 운영되었습니다.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
McCoy’s Medium Gibco 16600-082
Fetal Calf Serum Hyclone SH30070
Endothelial Cell Growth Medium Vec Technologies MCDB-131
Pooled Human Umbilical Vein Endothelial Cells Vec Technologies PHUVEC/T-25
Sulfuric Acid JT Baker 9681-02
Hydrogen Peroxide VWR BDH3742-1
(3-aminopropyl)triethoxysilane Aldrich 440140-100ML
Isopropyl Alcohol VWR BDH8999-4
Trypsin Cellgro 25-054-C1
Hank’s Buffered Salt Solution Gibco 14175-095
sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Scientific 21335
Streptavadin beads Dynabeads 112.06D
MFP-3D AFM Asylum Research
Tipless Cantilevers Nanoworld ARROW-TL1-50
Silhouette SD Quickutz Silhouette-SD
Silicone Rubber Stockwell Elastomerics SE50-RS
30 ml Syringes Benton Dickinson 309650
18 gauge needles Benton Dickinson 305196
Extension Sets Hospira 4429-48
4 way valves Teleflex W21372
Male/Female Port Caps Smith’s Medical MX491B
Peristaltic Pump Watson-Marlow 401U/D
Peristaltic Tubing Watson-Marlow 903.0016.016
sterile filters Pall Life Science 4652

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Cite This Article
Marsh, G., Waugh, R. E. Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (72), e50163, doi:10.3791/50163 (2013).

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