إعداد الحويصلية عملاق التصوير والتصحيح، المشبك الكهربية
Summary
إعادة تشكيل بروتينات الغشاء وظيفية في الجسيمات الشحمية العملاقة من تكوين المعرفة هو نهج قوية عندما يقترن الكهربية التصحيح، المشبك. ومع ذلك، قد يكون الإنتاج الحويصلية العملاقة التقليدية يتعارض مع استقرار البروتين. نحن تصف بروتوكولات لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة من الدهون نقية أو الجسيمات الشحمية صغيرة تحتوي على القنوات الأيونية.
Abstract
وقد تم إعادة تشكيل القنوات الأيونية في الأغشية الدهنية محددة الصفات كيميائيا لتسجيل الكهربية تقنية قوية لتحديد واستكشاف وظيفة هذه البروتينات الهامة. بيد أن الاستعدادات الكلاسيكية، مثل طبقات ثنائية مستو، والحد من التلاعب والتجارب التي يمكن القيام بها على قناة المعاد والبيئة غشاء لها. وتشبه خلية هيكل أكثر من الجسيمات الشحمية العملاقة يسمح تجارب التصحيح، المشبك التقليدية دون التضحية السيطرة على البيئة الدهون.
Electroformation هو يعني كفاءة لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة> 10 ميكرون في القطر الذي يعتمد على تطبيق التيار الكهربائي بالتناوب إلى رقيقة، فيلم الدهون أمرت تترسب على سطح القطب. ومع ذلك، وبما أن بروتوكول الكلاسيكية يدعو إلى الدهون لتودع من المذيبات العضوية، وأنه غير متوافق مع بروتينات الغشاء أقل قوة مثل القنوات الأيونية ويجب أن يتم تعديل. في الآونة الأخيرة، والعلاقات العامةوقد وضعت otocols إلى electroform الجسيمات الشحمية العملاقة من الجسيمات الشحمية الصغيرة المجففة جزئيا، والتي تكيفنا مع الجسيمات الشحمية تحتوي على البروتين في المختبر لدينا.
نقدم هنا الخلفية، ومعدات، وتقنيات، ومزالق electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة من التفرق الحويصلية الصغيرة. نبدأ مع بروتوكول الكلاسيكية، والتي ينبغي أن يتقن أولا قبل محاولة البروتوكولات أكثر تحديا التي تتبع. ونحن لشرح عملية جفاف جزئي للرقابة من الجسيمات الشحمية صغيرة باستخدام بخار التوازن مع حلول الملح المشبع. وأخيرا، ونحن لشرح عملية electroformation نفسها. سنقوم بشرح بسيط، تجهيزات رخيصة الثمن التي يمكن إجراؤها في المنزل لإنتاج الجسيمات الشحمية عالية الجودة، ووصف الفحص البصري للإعداد في كل مرحلة لضمان أفضل النتائج.
Introduction
الجسيمات الشحمية العملاقة (غالبا ما تسمى الحويصلات unilamellar العملاقة، أو GUVs) وقد استخدمت أساسا لدراسة الفيزياء والكيمياء الفيزيائية من طبقات ثنائية الدهون، بما في ذلك دراسات من تشوه طبقة ثنائية، الوحشي مرحلة التعايش ("الطوافات")، والانصهار الغشاء، الخ 1-4. لديهم بشكل صارخ مثل خلية هيكل: قذيفة كروية من الغشاء الذي يحيط الداخلية مائي والتي يمكن بسهولة أن يتم مختلفة من المخزن المؤقت المائية المحيطة بها. ، بحكم تعريفها، ≈ 1-100 ميكرون في القطر، بحيث يمكن تصويرها أنهم باستخدام مجموعة متنوعة من النهج المجهر الضوئي. يمكن أن تكون مصنوعة مشدود باستخدام التدرجات التناضحي أو التوتر تطبيقها ميكانيكيا، بحيث حين ميسرة عموما، يمكن التلاعب ممتلكاتهم لسهولة التعامل. على وجه الخصوص، والسيطرة على "صلابة" من الحويصلية يجعلها واضحة لتشكيل بقع "الحويصلية المرفقة" أو رفعه للالكهربية. في الماضي، تم إجراء إعادة ايون القناة إلى حد كبير في مستو الدهون بilayers. الآن، والقدرة على تشكيل بقع من الجسيمات الشحمية العملاقة واستخدام جعبة كبيرة من الأدوات التي وضعت لالكهربية التقليدية (المجهري مضان، micropipette الطموح، نضح السريع والتحكم في درجة الحرارة، الخ) يجعل الجسيمات الشحمية العملاقة جذابة على نحو متزايد للدراسات إعادة 5،6.
وقد بذلت الجسيمات الشحمية العملاقة من قبل العديد من الاستراتيجيات. في الواقع، الجسيمات الشحمية العملاقة تشكل عفويا من خلال عملية التورم عند ممهى فيلم الدهون المجففة 4،7،8. الرغبة في إعداد أكثر بسرعة أكبر، أدى الجسيمات الشحمية أكثر اتساقا الباحثين إلى أساليب أخرى، أهمها electroformation 1،9. يعتمد Electroformation أيضا على ترطيب فيلم الدهون المجففة، ولكن تسرع هذه العملية من خلال تطبيق مجال كهربائي تتأرجح عبر فيلم الدهون. يتم تطبيق هذا المجال من خلال قطبين، إما أسلاك البلاتين أو الإنديوم-أكسيد القصدير (ITO) شرائح الزجاج المطلي، وفصلها عن طريق المياه أوالعازلة والتي تترسب على نسبة الدهون. من خلال تسريع تورم الجسيمات الشحمية، واحد يحقق عائدات أعلى من الجسيمات الشحمية أكبر. وهكذا، أصبح electroformation الأسلوب الافتراضي لإنتاج الجسيمات الشحمية العملاقة 4.
آلية electroformation ليست مفهومة تماما، ويتم تطوير معظم بروتوكولات تجريبيا (على سبيل المثال 10،11). ومع ذلك، يمكننا أن نتعلم قليلا عن ما يمكن توقعه من خلال النظر في نظرية وبعض النتائج التجريبية. ويعتقد على نطاق واسع أن electroformation يحدث من قبل القيادة تدفق الكهربائية ناضح من عازلة بين طبقات ثنائية الدهون الفردية مكدسة في الفيلم الدهون المودعة 10،11. اقتران كهرباء لتقلبات الحرارية للطبقات ثنائية الدهون وربما أيضا المشاركة 12. هذه الفرضيات التنبؤ نوعيا الحدود العليا لتردد المجال الكهربائي والقوة التي يمكن استخدامها 10،12. على وجه الخصوص، فإنه من المتوقع أن الحلول عالية التوصيل ( <eم> أي حلول الملح الفسيولوجية) خفض القوات electrohydrodynamic التي قد تشرع في electroformation الحويصلية 12. انخفاض معدلات تدفق Electroosmotic عموما مع زيادة تركيز الملح وكثيرا ما بلغ ذروته في بعض الكهربائية تيرة التذبذب حقل (على سبيل المثال وإن كان ذلك في الهندسة المختلفة، الأخضر وآخرون 13). وبالتالي، شدة المجال العالي وترددات أعلى معقولة عن حلول الموصلية عالية، في حدود 10.
ومع ذلك، من المحتمل أن تكون غير متوافقة مع الأسلوب المعتاد لإيداع الدهون على أقطاب لهذا الإجراء electroswelling، وبالتحديد في المذيبات العضوية والتي يتم بعد ذلك تبخرت قبالة لترك فيلم الدهون رقيقة بروتينات الغشاء. هناك مسارين الرئيسي للتغلب على هذه الصعوبة: لإدراج البروتينات بعد تشكيل الحويصلية العملاقة، أو للتكيف مع الطريقة التي أودعت الدهون. نهجنا يبني على الآخرين 5،11 لإيداع الدهون وreconstituted بروتين غشاء معا من تعليق "proteoliposomes" صغيرة أو كبيرة. نحن تصف عملية طويلة وأكثر تحديا من إنتاج proteoliposomes من تنقية البروتين والدهون في مكان آخر (كولينز وغوردون، في الاستعراض). نحن هنا وصف بروتوكول في غياب أي بروتين، ولكنه هو نفسه عندما تم دمج بروتين، ونحن وتشمل النتائج تبين أن proteoliposomes تحتوي على قناة TRPV1 أيون يمكن أن تتحول إلى GUVs وتستخدم لالتصحيح، المشبك الكهربية. في أي نهج electroformation، الفحص البصري من العينة الدهون أثناء عملية ترسب الدهون أمر بالغ الأهمية لتحقيق النجاح.
نهجنا قد تكون ذات صلة وراء تطبيق المتخصصة لايون القناة إعادة. في الوقت منذ وضعنا أول هذا البروتوكول والآن، كما تم إثبات أنه الطريقة التي تترسب الدهون على أقطاب لelectroformation يؤثر على التجانس التركيبي للGUVs الناتجة عن ذلك. Baykآل كاغلار وآخرون. أظهرت أن 14 GUVs شكلت من الجسيمات الشحمية بعناية المجففة كان 2.5 مرات أصغر التباين في امتزاج درجة حرارة التحول من GUVs تشكلت من خليط من مختلف الدهون الفوسفاتية والكوليسترول. عملهم يشير إلى أن الدهون، وخصوصا الكوليسترول، قد يعجل من خليط الدهن عندما تودع من المذيبات العضوية، مما أدى إلى التباين المكاني كبير في تكوين الفيلم الدهون المودعة. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للدراسات من الدهون غشاء السلوك المرحلة، ولكن قد يكون أيضا عاملا حاسما للتجارب الكمية على وظيفة القناة الايونية. بايكال-كاغلار وآخرون. 'ق بروتوكول مماثل ولكن ليست متطابقة إلى منطقتنا، ونحن نشجع القراء لدراستها كذلك.
هذا البروتوكول (انظر نظرة عامة، والشكل 1) هو واحد من العديد من التي يمكن استخدامها. في نجاح electroformation مبدأ يعتمد على خليط الدهون، الماء، درجة الحرارة، والمواد المذابة الأخرى (وخاصة أيونات)، وللبالطبع الجهد والتردد المستخدمة في التشكيل. كما يصبح electroformation فهم أفضل، ونحن نتوقع أن صقل بروتوكول لدينا أكثر من ذلك.
وأخيرا، غالبا ما يكون هناك منحنى التعلم حاد في electroforming الجسيمات الشحمية العملاقة. نقترح اتقان بروتوكول التقليدية (الأقسام 1 و 4، وإذا لزم الأمر، القسم 5) قبل أن تعلم أن تودع الدهون من الايقاف الليبوسومال (الأقسام 2-5).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضعت Electroformation من الجسيمات الشحمية العملاقة إلى تقنية مرنة متوافقة مع الدهون المختلفة، والأعمال التحضيرية، ومخازن. التحكم الدقيق في عملية ترسب الدهون هو الأكثر أهمية لتحقيق النجاح. لقد قدمنا أدوات بسيطة لجعل ترسب الدهون رقابة من الاستعدادات الحويصلية صغيرة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بريان Venema واريك مارتنسون لبناء جهاز electroformation. وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للعلوم الطبية العامة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM100718 إلى SEG) والمعهد الوطني للعيون التابع لمعاهد الصحة القومية (R01EY017564 إلى SEG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Luisi, P. L., Walde, P. . Giant Vesicles. , (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. . International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H., Cevc, G. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. , (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
