Giant liposoombereiding for Imaging en patch-clamp elektrofysiologie
Summary
Reconstructie van functionele membraaneiwitten in gigantische liposomen van gedefinieerde samenstelling is een krachtige aanpak in combinatie met patch-clamp elektrofysiologie. Echter, kunnen conventionele reus liposoom productie onverenigbaar met eiwitstabiliteit. We beschrijven protocollen voor het produceren gigantische liposomen uit pure lipiden of kleine liposomen die ionkanalen.
Abstract
De reconstitutie van ionenkanalen in chemisch gedefinieerde lipidemembranen voor elektrofysiologische opname is een krachtige techniek om de functie van deze belangrijke eiwitten te identificeren en te onderzoeken. Echter, klassieke bereidingen, zoals vlakke dubbellagen, beperken de manipulaties en experimenten die worden uitgevoerd op de gereconstitueerde kanaal en zijn membraan omgeving. De meer cel-achtige structuur van reusachtige liposomen traditionele patch-clamp experimenten toelaat zonder dat de controle van het lipide-omgeving.
Electroformation is een efficiënt middel om grote liposomen> 10 micrometer diameter die berust op de toepassing van wisselspanning een dunne, geordende lipide film afgezet op een elektrodeoppervlak. Aangezien de klassieke protocol gaat de lipiden worden afgezet uit organische oplosmiddelen, is niet compatibel met minder robuuste membraaneiwitten zoals ionkanalen en worden gewijzigd. Onlangs, protocols ontwikkeld om grote liposomen electroform uit gedeeltelijk gedehydrateerde kleine liposomen, die we hebben aangepast aan eiwit-bevattende liposomen in ons laboratorium.
Wij presenteren hier de achtergrond, uitrusting, technieken en valkuilen van electroformation van reusachtige liposomen van kleine liposoom dispersies. We beginnen met de klassieke protocol, die eerst moet worden beheerst voordat de meer uitdagende protocollen die volgen. We tonen het proces van gecontroleerde gedeeltelijke dehydratatie van kleine liposomen met dampevenwicht met verzadigde zoutoplossingen. Tenslotte tonen we het proces electroformation zelf. We zullen eenvoudige, goedkope apparatuur die kan worden gemaakt in huis om hoogwaardige liposomen en beschrijven visueel onderzoek van het preparaat bij elke fase om de beste resultaten te beschrijven.
Introduction
Giant liposomen (vaak grote unilamellaire blaasjes of GUVs) zijn voornamelijk gebruikt in de fysica en fysische chemie van lipide bilagen, inclusief studies dubbellaag vervorming, laterale phase coëxistentie ("vlotten"), membraanfusie, etc 1-4 bestuderen. Ze hebben een grove cel-structuur: bolvormige schil van membraan rond een waterige interieur dat gemakkelijk anders dan het omringende waterige buffer kan worden gemaakt. Ze worden per definitie ≈ 1-100 micrometer diameter, zodat ze kunnen worden afgebeeld met verschillende lichtmicroscopie benaderingen. Ze kunnen strak met osmotische gradiënten of mechanisch aangebrachte spanning worden gemaakt, zodat tijdens het algemeen zacht, hun eigenschappen kunnen worden gemanipuleerd voor eenvoudig gebruik. Met name het regelen van de "stijfheid" van het liposoom is het eenvoudig om "liposoom toegevoegd" of uitgeschakelde patches voor elektrofysiologie vormen. In het verleden werd ionkanaal reconstitutie grotendeels uitgevoerd in vlakke lipide bilayers. Nu de mogelijkheid om patches van grote liposomen en gebruik de aanzienlijke trilling van conventionele methoden ontwikkeld voor elektrofysiologie (fluorescentiemicroscopie micropipet aspiratie, snelle perfusie en temperatuur, etc.) met grote liposomen steeds aantrekkelijker voor reconstitutie studies 5,6.
Giant liposomen door veel strategieën. In feite, reuze liposomen spontaan door een zwelling proces bij een gedroogde lipidefilm gehydrateerd 4,7,8. De wens om sneller te bereiden grotere, meer uniforme liposomen leidde onderzoekers tot andere benaderingen, leider onder hen electroformation 1,9. Electroformation steunt ook op hydratatie van droge lipide film, maar versnelt het proces de toepassing van een oscillerend elektrisch veld over de lipide film. Het veld wordt via twee elektroden, hetzij platina draden of indium-tin-oxide (ITO) gecoate objectglaasjes, gescheiden door water ofbuffer en waarop de lipiden worden afgezet. Door het versnellen van de zwelling van liposomen, bereikt men een hogere opbrengst van de grotere liposomen. Zo heeft electroformation uitgegroeid tot de standaard methode om gigantische liposomen produceren 4.
Het mechanisme van electroformation niet volledig begrepen, en de meeste protocollen empirisch ontwikkeld (bijvoorbeeld 10,11). Toch kunnen we een beetje over wat te verwachten bij het overwegen van de theorie en enkele empirische resultaten te leren. Het wordt algemeen aangenomen dat electroformation gebeurt door een elektro-osmotische stroming van buffer tussen afzonderlijke lipide bilagen gestapeld in de afgezette film lipide 10,11. Elektrostatische koppeling thermische fluctuaties van de lipide bilagen is waarschijnlijk ook betrokken 12. Deze hypotheses kwalitatief voorspellen plafonds voor het elektrische veld frequentie en kracht die kan worden gebruikt 10,12. In het bijzonder wordt voorspeld dat oplossingen hoge geleidbaarheid ( <em> dwz fysiologische zoutoplossingen) verminderen de elektrohydrodynamische krachten die het liposoom electroformation kunnen initiëren 12. Elektro debieten algemeen af met toenemende zoutconcentratie en vaak piekte op een elektrisch veld oscillatiefrequentie (bijv. zij in een andere geometrie, Green et al.. 13). Zo hogere veldsterktes en hogere frequenties zijn redelijk voor hoge geleidbaarheid oplossingen, binnen de grenzen 10.
Echter, membraaneiwitten waarschijnlijk onverenigbaar met de gebruikelijke methode van aanbrengen van lipiden op elektroden voor electroswelling procedure, namelijk in organische oplosmiddelen worden vervolgens afgedampt in een dunne lipide film verlaten. Er zijn twee belangrijkste wegen rond deze moeilijkheid: om eiwitten te nemen na het gigantische liposoomvorming, of aan te passen hoe de lipiden worden afgezet. Onze benadering bouwt voort op anderen 5,11 om de lipiden en gereconstitueerd deponerenstitueerde membraaneiwit samen uit een suspensie van kleine of grote "proteoliposomen". We beschrijven de langdurige en meer uitdagende proces van het produceren proteoliposomen uit gezuiverde eiwitten en lipiden elders (Collins en Gordon, in review). Hier beschrijven we het protocol in de afwezigheid van eiwit, maar het is hetzelfde als eiwit is opgenomen, we zijn waaruit blijkt dat proteoliposomen die het ionkanaal TRPV1 kunnen worden omgezet in GUVs en gebruikt voor patch-clamp elektrofysiologie. In elk electroformation benadering visueel onderzoek van het monster tijdens de lipide lipide depositieproces is essentieel voor het succes.
Onze aanpak kan dan de gespecialiseerde toepassing om ionkanaal reconstitutie relevant zijn. In de tijd omdat wij eerst dit protocol ontwikkeld en nu is ook aangetoond hoe de wijze welke lipiden worden afgezet op elektroden electroformation invloed op de samenstelling van de verkregen heterogeniteit GUVs. Baykal-Caglar et al.. 14 bleek dat GUVs gevormd uit zorgvuldig gedroogde liposomen hadden een 2,5 keer kleiner variaties in de mengbaarheid overgangstemperatuur van GUVs gevormd uit mengsels van verschillende fosfolipiden en cholesterol. Hun werk geeft aan dat lipiden, en in het bijzonder cholesterol, kan neerslaan uit de lipide mengsel bij afgezet uit organische oplosmiddelen, wat resulteert in grote ruimtelijke variatie in de samenstelling van de afgezette lipide film. Dit is vooral in studies van lipide membraan fasegedrag, maar kan ook van cruciaal belang kwantitatieve experimenten ionenkanalen. Protocol Baykal-Caglar et al.. 'S is vergelijkbaar, maar niet identiek aan onze eigen, en de lezers worden aangemoedigd om het te bestuderen als goed.
Dit protocol (zie overzicht, figuur 1) is een van vele die kunnen worden gebruikt. In principe electroformation succes hangt af van het lipidemengsel, hydratatie, temperatuur, andere opgeloste stoffen (vooral ionen), enNatuurlijk is de spanning en frequentie die in formatie. Zoals electroformation beter wordt begrepen, verwachten we ons protocol meer te verfijnen.
Tot slot, is er vaak een steile leercurve in elektrovormen gigantische liposomen. Wij stellen voor het beheersen van het conventionele protocol (afdelingen 1 en 4, en, indien nodig, sectie 5) voor het leren om lipiden storten van liposomaal schorsingen (secties 2-5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Electroformation van reusachtige liposomen heeft zich ontwikkeld tot een flexibele techniek die compatibel is met diverse lipiden, preparaten en buffers. Zorgvuldige controle van het lipide afzetting is het meest essentieel voor het succes. We hebben eenvoudige hulpmiddelen gepresenteerd aan gecontroleerde afzetting van lipiden uit kleine liposoompreparaten een eenvoudig proces te maken. De relatieve vochtigheid is essentieel voor juiste dehydratatie van de oorspronkelijke liposomen, en de optimale waarde afhankelijk va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Bryan Venema en Eric Martinson voor het construeren van de electroformation apparaat. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Algemene Medische Wetenschappen van de National Institutes of Health (R01GM100718 aan SEG) en het Nationale Instituut van de National Institutes of Health Eye (R01EY017564 aan SEG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Luisi, P. L., Walde, P. . Giant Vesicles. , (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. . International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H., Cevc, G. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. , (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
