Preparação de lipossomas gigantes por Imagem e patch-clamp Eletrofisiologia

Summary

Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.

Abstract

A reconstituição de canais de iões em membranas de lípidos quimicamente definidos para a gravação electrofisiológico tem sido uma técnica poderosa para identificar e explorar a função destas proteínas importantes. No entanto, as preparações clássicas, tais como bicamadas planares, limitar as manipulações e experiências que podem ser realizadas sobre o canal reconstituída e seu ambiente de membrana. A estrutura mais células como de lipossomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionais, sem sacrificar o controle do ambiente lipídico.

Eletropolimerização é um meio eficiente para a produção de lipossomas gigantes> 10 m de diâmetro, que se baseia na aplicação de tensão alternada a um filme lipídico fina, ordenado depositado sobre uma superfície do eletrodo. No entanto, uma vez que o protocolo clássico chama para os lipidos a ser depositados a partir de solventes orgânicos, que não é compatível com as proteínas de membrana menos robustas como canais iónicos e devem ser modificadas. Recentemente, protocols têm sido desenvolvidos para electroform lipossomas gigantes parcialmente desidratadas de lipossomas pequenos, que se adaptaram aos lipossomas contendo proteína no nosso laboratório.

Apresentamos aqui a fundo, equipamentos, técnicas e armadilhas da eletropolimerização de lipossomas gigantes de pequenas dispersões de lipossomas. Começamos com o protocolo clássico, que deve ser dominado antes de tentar os protocolos mais difíceis que se seguem. Demonstramos o processo de desidratação parcial controlada de pequenos lipossomas utilizando o equilíbrio do vapor com as soluções salinas saturadas. Finalmente, demonstramos o próprio processo de eletroformação. Iremos descrever equipamentos, simples e barato, que pode ser feita em casa para produzir lipossomas de alta qualidade, e descrevem a inspecção visual da preparação, em cada fase para assegurar os melhores resultados.

Introduction

Lipossomas gigantes (muitas vezes chamado de vesículas unilamelares gigantes, ou GUVs) foram principalmente usados ​​para estudar a física ea química física de bicamadas lipídicas, incluindo estudos de deformação bicamada, a convivência fase lateral ("jangadas"), a fusão da membrana, etc ^1-4. Eles têm uma estrutura de célula grosseira, como: concha esférica de membrana que envolve um interior aquoso, que pode ser feita facilmente diferente do tampão aquoso circundante. Eles são, por definição, ≈ 1-100 um de diâmetro, de forma que possam ser visualizados utilizando uma variedade de abordagens de microscopia de luz. Elas podem ser feitas usando tenso gradientes osmóticos ou tensão aplicadas mecanicamente, de modo que, embora geralmente macia, as suas propriedades podem ser manipuladas para um manuseamento fácil. Em particular, controlando a "dureza" do lipossoma torna mais simples para formar manchas "lipossoma inscritos" ou excisada para electrofisiologia. No passado, a reconstituição do canal iónico foi amplamente praticada em planar lípido bilayers. Agora, a capacidade para formar manchas de lipossomas gigantes e usar o tremor considerável de ferramentas desenvolvidas para electrofisiologia convencional (microscopia de fluorescência, micropipeta aspiração, perfusão rápida e controlo de temperatura, etc), faz com que os lipossomas gigantes cada vez mais atraente para os estudos de reconstituição ^5,6.

Lipossomas gigantes tenham sido feitas por muitas estratégias. Na verdade, os lipossomas formam-se espontaneamente gigantes por um processo de inchamento quando um filme de lípido seco é reidratado ^4,7,8. O desejo de preparar mais rapidamente maior, lipossomas mais uniformes levou os pesquisadores a outras abordagens, o principal deles eletropolimerização ^1,9. Eletroformação também depende da hidratação de uma película de lípido seca, mas acelera o processo através da aplicação de um campo eléctrico oscilante do outro lado da película de lípido. O campo é aplicada através de dois eletrodos, tanto fios de platina ou de índio-estanho-Oxide (ITO) lâminas de vidro revestidas, separados por água outamponar e sobre o qual são depositados os lípidos. Ao acelerar o inchaço dos lipossomas, se consegue um maior rendimento de lipossomas maiores. Assim, eletropolimerização tornou-se o método padrão para a produção de lipossomas gigantes ^4.

O mecanismo de eletropolimerização não é totalmente compreendida, e a maioria dos protocolos são desenvolvidos empiricamente (por exemplo, ^10,11). No entanto, podemos aprender um pouco sobre o que esperar, considerando a teoria e alguns resultados empíricos. Acredita-se que eletropolimerização ocorre por condução fluxo eletro-osmótico de tampão entre bicamadas lipídicas individuais empilhados no filme lipídico depositado ^10,11. Acoplamento electrostático a flutuações térmicas das bicamadas lipídicas é também provavelmente envolvidos ^12. Estas hipóteses qualitativamente prever os limites superiores para a frequência e a força do campo eléctrico que pode ser usado ^10,12. Em particular, prevê-se que as soluções de elevada condutividade ( <em> ou seja, soluções fisiológicas sal) reduzir as forças eletro que podem iniciar a eletropolimerização lipossomas ^12. Vazões eletroosmótico geralmente diminuem com o aumento da concentração de sal e são frequentemente culminado em alguma freqüência de oscilação do campo elétrico (por exemplo, embora em uma geometria diferente, Green et al. ^13). Assim, maiores intensidades de campo e freqüências mais altas são razoáveis ​​para soluções de alta condutividade, dentro dos limites de ^10.

No entanto, as proteínas de membrana são susceptíveis de ser incompatível com o método usual de lípidos para depositar eléctrodos electroswelling para o procedimento, isto é, em solventes orgânicos, os quais são, em seguida, evapora-se para deixar uma fina película de lípido. Existem dois caminhos principais contornar esta dificuldade: a incorporar proteínas após a formação de lipossomas gigante, ou para adaptar a forma como os lípidos sejam depositados. Nossa abordagem baseia-se em outros ^5,11 para depositar os lipídios e reconstituiçãotuído proteína de membrana juntos a partir de uma suspensão de pequenas ou grandes "proteolipossomos". Nós descrevemos o processo demorado e mais difícil de produzir proteolipossomos de proteína e lipídios purificada em outro lugar (Collins e Gordon, em revisão). Aqui descrevemos o protocolo, na ausência de qualquer proteína, mas é o mesmo quando a proteína é incorporada, que incluem os resultados que mostram que proteolipossomas contendo o canal de TRPV1 de iões pode ser transformado em GUVs e usado para de patch-clamp electrofisiologia. Em qualquer abordagem eletropolimerização, a inspeção visual da amostra de lipídios durante o processo de deposição de lipídios é fundamental para o sucesso.

Nossa abordagem pode ser relevante para além da aplicação especializada para canal de reconstituição de íons. No momento, uma vez que este protocolo desenvolvido pela primeira vez e, agora, tem sido também demonstrado como a maneira em que os lípidos são depositadas sobre os eléctrodos para eletroformação afecta a heterogeneidade da composição dos GUVs resultantes. Baykai-Caglar et al. mostrou que ¹⁴ GUVs formados a partir de lipossomas cuidadosamente desidratados apresentou uma menor variação de 2,5 vezes na temperatura de transição de miscibilidade GUVs formados a partir de misturas de diferentes fosfolipidos e colesterol. O trabalho indica que os lípidos, e especialmente o colesterol, pode precipitar a partir da mistura de lípidos, quando depositados a partir de solventes orgânicos, o que resulta em grande variação espacial da composição do filme de lípidos depositado. Isto é especialmente importante para os estudos de comportamento de fase da membrana lipídica, mas também pode ser crucial para as experiências quantitativas na função do canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al 's. É semelhante, mas não idêntico ao nosso, e os leitores são encorajados a estudar também.

Este protocolo (ver descrição, a Figura 1) é uma das muitas que poderiam ser usadas. Em princípio, o sucesso da eletroformação depende da mistura de lípidos, a hidratação, a temperatura, outros solutos (principalmente iões), e deClaro que a tensão ea frequência usada em formação. Como eletropolimerização torna-se melhor compreendida, esperamos aperfeiçoar nosso protocolo mais.

Finalmente, muitas vezes há uma curva de aprendizagem em galvanoplastia lipossomas gigantes. Sugerimos dominar o protocolo convencional (Seções 1 e 4, e, se necessário, Seção 5) antes de aprender a depositar lipídios a partir de suspensões de lipossomas (seções 2-5).

Protocol

1. Deposição de lipídios a partir de solventes orgânicos: Protocolo Classical Remover os lípidos de armazenamento à temperatura de -20 ° C ou -80 ° C, aquecer até à TA Cuidado:. Lípidos são extremamente higroscópico, e muitos são sensíveis ao oxigénio. Cobertura de lípidos em árgon seco ou azoto gasoso e em todos os passos para minimizar a exposição ao ar. Se necessário, suspender os lipídios em clorofórmio ou ciclo-hexano em mg / ml 1-10, nota que as…

Representative Results

Nos nossos exemplos, podemos preparar lipossomas a partir de uma mistura de cerca de 55 mol% de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% molar POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfo , 30 mol% de colesterol e 0,1% molar de Texas Red-rotulado 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composição foi escolhida como representante de aproximadamente lípidos do gânglio da raiz dorsal 18. Notamos que 15% em mol carregada lípido (aqui POP) está perto do l…

Discussion

Eletropolimerização de lipossomas gigantes tornou-se uma técnica flexível compatível com diversos lipídios, preparações, e tampões. O controle cuidadoso do processo de deposição de lipídios é o mais crítico para o sucesso. Nós apresentamos ferramentas simples para fazer a deposição controlada de lipídios a partir de pequenas preparações de lipossomas um processo simples. A humidade relativa é crítico para o bom desidratação dos lipossomas iniciais, e o valor óptimo variará com a concentração …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667