Гигантские липосом для работы с изображениями и патч-зажим электрофизиологии
Summary
О восстановлении функциональных белков мембраны в гигантские липосомы определенного состава является мощным подходом в сочетании с патч-зажим электрофизиологии. Однако обычные производственные липосома гигантский могут быть несовместимы с стабильности белка. Мы описываем протоколы для производства гигантских липосом из чистого липидов или небольших липосом, содержащих ионные каналы.
Abstract
Восстановления ионных каналов в химически определенных липидов мембран для электрофизиологические записи был мощный метод для выявления и изучения функции этих важных белков. Тем не менее, классические препараты, такие как плоские бислоев, ограничивают манипуляций и эксперименты, которые могут быть выполнены на восстановленный канал и его мембрана среды. Чем больше клеточной структуры гигантских липосом позволяет традиционных патч-зажим эксперименты не жертвуя контролем липидного среды.
Electroformation является эффективным средством для получения гигантских липосом> 10 мкм в диаметре, который основан на применении переменного напряжения в тонкой липидной пленки упорядоченной осажденных на поверхности электрода. Однако, так как классический протокол предусматривает липидов на хранение из органических растворителей, не совместимы с менее надежными мембранных белков, как ионные каналы и должна быть изменена. В последнее время PRotocols были разработаны для Electroform гигантские липосомы из частично обезвоженной небольшой липосомы, которые мы адаптировали к белку содержащих липосомы в нашей лаборатории.
Мы приведем здесь фоне, оборудования, техники и ловушки electroformation гигантских липосом от небольших липосомы дисперсий. Начнем с классического протокола, которая должна быть освоена, прежде чем пытаться более сложные протоколы, которые следуют. Мы продемонстрировать процесс контролируемого частичному обезвоживанию малых липосом использованием паров равновесии с насыщенными растворами солей. Наконец, мы демонстрируем процесс electroformation себя. Мы опишем простым, недорогим оборудованием, которое может быть сделано в лабораторных условиях для производства высококачественного липосомы и описать визуальный осмотр подготовки на каждом этапе, чтобы обеспечить наилучшие результаты.
Introduction
Гигантские липосомы (часто называемые гигантские однослойные везикулы, или GUVs) имеют в основном были использованы для изучения физики и физической химии липидного бислоя, в том числе исследования двухслойных деформации, боковой фазе сосуществования («плоты»), слияние мембран и т.д. 1-4. Они имеют чрезвычайно клеточной структуры: сферической оболочки мембраны, окружающей водной внутренний которые могут быть легко сделаны различные чем окружающие водном буфере. Они, по определению, ≈ 1-100 мкм в диаметре, так что они могут быть отображены с использованием различных подходов свет микроскопии. Они могут быть сделаны тугими использованием осмотических градиентов или механически применяться напряжение, так что в то время как обычно мягкие, их свойства можно манипулировать для легкой обработки. В частности, управление «жесткость» в липосомы делает его простым, чтобы сформировать "липосомы прилагается» или вырезают патчи для электрофизиологии. В прошлом, ионный канал восстановления в значительной степени выполнена в плоской б липидовilayers. Теперь, способность образовывать пятна от гигантских липосом и использовать значительную дрожь средства, разработанные для обычных электрофизиологии (флуоресцентной микроскопии, микропипетки аспирации, быстрой перфузии и контроля температуры, и т.д.) делает гигантские липосомы более привлекательной для приготовления исследования 5,6.
Гигантские липосомы были сделаны многие стратегии. В самом деле, гигантские липосомы образуют спонтанно процесс набухания Когда сухой липидной пленки регидратируют 4,7,8. Желание быстрее подготовить большее, более равномерное липосом привело исследователей к другим подходам, главным из которых electroformation 1,9. Electroformation также зависит от гидратации высушенного липидную пленку, но ускоряет процесс путем применения переменного электрического поля через липидную пленку. Поле прикладывается через два электрода, либо проводов платины или индия-олова (ITO) покрытием предметные стекла, разделенных водой илибуфер и на которую липиды откладываются. За счет ускорения набухания липосомы, он достигает более высокий выход больше липосомы. Таким образом, electroformation стал метод по умолчанию для производства гигантских липосом 4.
Механизм electroformation полностью не изучен, и большинство из протоколов разработаны эмпирически (например, 10,11). Тем не менее, мы можем узнать немного о том, что ожидать с учетом теории и некоторые эмпирические результаты. Широко распространено мнение, что electroformation происходит при движении электро-осмотического потока буфера между отдельными бислоя липидов укладываются в осажденной липидная пленка 10,11. Электростатический связь с тепловыми флуктуациями липидного бислоя, вероятно, также участвуют 12. Эти гипотезы качественно предсказать верхний предел частоты электрического поля и силы, которые могут быть использованы 10,12. В частности, он предсказал, что решения высокой проводимостью ( <eM> т.е. физиологические растворы солей) уменьшить электрогидродинамическое сил, которые могут инициировать липосомы electroformation 12. Электроосмотического потока обычно уменьшается с увеличением концентрации солей и часто достиг максимума в некоторой частотой колебаний электрического поля (например, хотя и в различной геометрии, зеленый и др.. 13). Таким образом, более высокие значения напряженности поля и высокие частоты разумны для решений высокой проводимостью, в пределах 10.
Тем не менее, мембранные белки могут быть несовместимы с обычным методом осаждения липидов на электроды для electroswelling процедура, а именно в органических растворителях, которые затем выпаривают, чтобы оставить тонкой липидной пленки. Существуют два основных пути обойти эту трудность: включение белков после гигантских липосом, или адаптироваться, как липиды откладываются. Наш подход основан на других 5,11 внести липидов и восстановления имtuted мембранного белка вместе с суспензией малые или большие "протеолипосом". Мы описываем длительный и более сложный процесс производства протеолипосомами из очищенных белков и липидов в другом месте (Коллинз и Гордон, в обзоре). Здесь мы описываем протокола в отсутствие какого-либо белка, но это то же самое, когда белок включена; мы включаем результаты, показывающие, что протеолипосом содержащий ионный канал TRPV1 может быть преобразована в GUVs и используется для патч-зажим электрофизиологии. В любом electroformation подход, визуальный осмотр липидного образца во время процесса осаждения липид имеет решающее значение для успеха.
Наш подход может иметь отношение пределы специальной приложение восстановления ионного канала. За время как мы впервые разработана этот протокол и сейчас было также показано, каким образом способ, в котором липиды откладываются на электродах для electroformation влияет на композиционной гетерогенности результате GUVs. Baykаль-Caglar соавт. 14 показано, что GUVs сформированный из тщательно обезвоженный липосом была в 2,5 раза меньше изменение температуры растворимость переход GUVs сформированы из смеси различных фосфолипидов и холестерина. Их работа показывает, что липиды и особенно холестерина, может выпадать в осадок из липидной смеси при осаждении из органических растворителей, в результате чего большое пространственное изменение в составе осажденного липидной пленки. Это особенно важно для изучения фазового поведения липидов мембран, но также может иметь решающее значение для количественных экспериментов по функции ионного канала. Байкал-Caglar соавт. С протоколом похожа, но не идентична нашей, Читателям предлагается изучить его, а также.
Этот протокол (см. обзор, рис. 1) является одним из многих, которые могут быть использованы. В принципе успех electroformation зависит от смеси липидов, гидратации, температура, другие растворенные вещества (в частности, ионов), а такжеКонечно, напряжения и частоты, используемые в формировании. Как electroformation становится более понятным, мы рассчитываем усовершенствовать наш протокол больше.
Наконец, часто крутой кривой обучения в гальванопластики гигантские липосомы. Мы предлагаем освоение обычного протокола (разделы 1 и 4, и, при необходимости, раздел 5) перед обучением внести липидов из липосомальной суспензии (разделы 2-5).
Protocol
Representative Results
Discussion
Electroformation гигантских липосом превратился в гибкую технику совместимы с различным липиды, препараты, и буферы. Тщательный контроль процесса осаждения липидов наиболее важными для успеха. Мы представили простые инструменты, чтобы сделать контролируемое осаждение липидов из небольших л…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Венема Брайан и Эрик Мартинсон построения electroformation аппарата. Эта работа финансировалась грантами от Национального института общих медицинских наук Национального института здоровья (R01GM100718 к SEG) и Национального Института глаза Национального института здоровья (R01EY017564 к SEG).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Luisi, P. L., Walde, P. . Giant Vesicles. , (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158, 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. . International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H., Cevc, G. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. , (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
