Giant liposomfremstilling for billedbehandling og Patch-Clamp Elektrofysiologi

Summary

Færdigtilberedning funktionelle membranproteiner i kæmpeliposomer af definerede sammensætning er en kraftfuld metode, når det kombineres med patch-clamp elektrofysiologi. Dog kan konventionelle kæmpe liposomproduktion være uforeneligt med protein stabilitet. Vi beskriver protokoller til at lave kæmpeliposomer fra rene lipider eller små liposomer indeholdende ionkanaler.

Abstract

Genoprettelse af ionkanaler i kemisk definerede lipid membraner til elektrofysiologiske optagelse er blevet en kraftfuld teknik til at identificere og udforske funktionen af ​​disse vigtige proteiner. Men klassiske præparater, såsom plane dobbeltlag, begrænse manipulationer og eksperimenter, der kan udføres på den rekonstituerede kanal og dens membran miljø. Jo mere celle-lignende struktur af kæmpeliposomer tillader traditionelle patch-clamp eksperimenter uden at ofre kontrol af lipidet miljø.

Electroformation er en effektiv middel til at producere kæmpeliposomer> 10 um i diameter, som bygger på anvendelse af vekselspænding til en tynd, ordnet lipidfilm aflejret på en elektrode overflade. Men da den klassiske protokol kræver at lipiderne skal deponeres fra organiske opløsningsmidler, er det ikke kompatibelt med mindre robuste membranproteiner som ionkanaler og må modificeres. For nylig, PRotocols er blevet udviklet til electroform kæmpeliposomer fra delvis tørrede små liposomer, som vi har tilpasset til protein-holdige liposomer i vores laboratorium.

Vi præsenterer her baggrunden, udstyr, teknikker og faldgruber electroformation af kæmpeliposomer fra små liposomdispersioner. Vi begynder med den klassiske protokollen, som skal beherskes først, inden du forsøger de mere udfordrende protokoller, der følger. Vi illustrerer fremgangsmåden kontrolleret delvis dehydrering af små liposomer anvender damp ligevægt med mættede saltopløsninger. Endelig viser vi processen electroformation selv. Vi vil beskrive enkle, billige udstyr, der kan gøres in-house til at producere høj kvalitet liposomer, og beskrive visuel inspektion af præparatet på hvert trin for at sikre de bedste resultater.

Introduction

Kæmpeliposomer (ofte kaldet gigantiske unilamelvesikler eller GUVs) har primært været brugt til at studere fysik og fysisk kemi lipiddobbeltlagene, herunder undersøgelser af tolags deformation, lateral fase sameksistens ("flåder"), membranfusion mv ^1-4. De har en groft celle-lignende struktur: kugleskal membran omgiver en vandige indre, som let kan gøres anderledes end det omgivende vandige puffer. De er per definition ≈ 1-100 um i diameter, så de kan afbildes ved hjælp af en række lysmikroskopi tilgange. De kan gøres ud med den osmotiske gradienter eller mekanisk anvendes spænding, således at mens generelt bløde, kan deres egenskaber blive manipuleret for nem håndtering. Især styrer "stivhed" af liposomet gør det ligetil at danne "liposom-tilsluttede" eller udskåret patches til elektrofysiologi. I fortiden blev ionkanal rekonstituering hovedsageligt udført i plan lipid Bilayers. Nu, evnen til at danne patches fra kæmpeliposomer og bruge betydelige sitre af værktøjer udviklet til konventionel elektrofysiologi (fluorescens mikroskopi, mikropipette aspiration, hurtig perfusion og temperaturstyring, etc.) gør kæmpeliposomer mere attraktivt for rekonstitution undersøgelser ^5,6.

Kæmpeliposomer er blevet foretaget af mange strategier. Faktisk danner kæmpeliposomer spontant ved en hævelse proces, når en tørret lipidfilm rehydreres ^4,7,8. Ønsket om at hurtigere forberede større, mere ensartede liposomer fået forskerne til at andre tilgange, overstyrmænd blandt dem electroformation ^1,9. Electroformation ligeledes påberåbt sig hydrering af tørrede lipid film, men fremskynder processen ved anvendelse af et oscillerende elektrisk felt på tværs af lipid film. Feltet påføres gennem to elektroder, enten platin ledninger eller indium-Tin-oxid (ITO) belagt glas dias, adskilt af vand ellerbuffer og på hvilke lipider er deponeret. Ved at fremskynde hævelse af liposomer, opnår man et højere udbytte af større liposomer. Således har electroformation blevet standard metode til at producere kæmpeliposomer ^4..

Mekanismen af electroformation er ikke fuldt forstået, og de ​​fleste af de protokoller udviklet empirisk (f.eks ^10,11). Alligevel kan vi lære lidt om hvad de kan forvente ved at overveje teori og nogle empiriske resultater. Det er en udbredt opfattelse, at electroformation sker ved kørsel elektro-osmotisk strøm af buffer mellem de enkelte lipiddobbeltlag stablet i den deponerede lipidfilm ^10,11. Elektrostatisk kobling til termiske udsving i lipiddobbeltlagene er formentlig også involveret ^12.. Disse hypoteser kvalitativt forudsige øvre grænser for det elektriske felt frekvens og styrke, der kan anvendes ^10,12. I særdeleshed er det forudsagt, at høje ledeevne løsninger ( <em> dvs fysiologiske saltopløsninger) reducere elektrohydrodynamiske kræfter, der kan udløse liposom electroformation ^12. Elektroosmotisk strømningshastigheder reduceres generelt med stigende saltkoncentration og ofte toppede på nogle elektrisk felt oscillationsfrekvens (f.eks omend i en anden geometri, Green et al. ^13). Således højere feltstyrker og højere frekvenser er rimelige for høj ledeevne løsninger inden for grænser ^10.

Men membranproteiner sandsynligvis vil være uforeneligt med den sædvanlige metode for at deponere lipider onto elektroder til electroswelling procedure, nemlig i organiske opløsningsmidler, som derefter afdampes til at forlade en tynd lipid film. Der er to primære stier omkring dette problem: at inkorporere proteiner efter gigantiske liposomdannelse eller tilpasse hvordan lipiderne er deponeret. Vores tilgang bygger på andres ^5,11 til at deponere lipider og reconstituted membran protein sammen fra en suspension af små eller store "proteoliposomer". Vi beskriver den langvarige og mere udfordrende proces at producere proteoliposomer fra oprenset protein og lipider andetsteds (Collins og Gordon, i gennemgang). Her beskriver vi protokollen i mangel af protein, men det er det samme, når protein er integreret; inkluderer vi resultater, der viser, at proteoliposomer indeholder ionkanal TRPV1 kan omdannes til GUVs og anvendes til patch-clamp elektrofysiologi. Under alle electroformation tilgang, er visuel inspektion af lipid prøven under lipidaflejring proces afgørende for succes.

Vores tilgang kan være relevant uden for specialiseret program til ion-kanal rekonstituering. I den tid, da vi først udviklet denne protokol, og nu er det også blevet vist, hvordan den måde, som lipider er deponeret på elektroder til electroformation påvirker kompositoriske heterogenitet af de resulterende GUVs. Baykal-Caglar et al. ^14. viste, at GUVs dannet ud fra omhyggeligt dehydrerede liposomer havde en 2,5 gange mindre variation i blandbarhed overgang temperatur GUVs dannet ud fra blandinger af forskellige phospholipider og kolesterol. Deres arbejde viser, at lipider og især kolesterol, kan bundfald lipidblandingen når aflejres fra organiske opløsningsmidler, hvilket resulterer i store rumlige variation i sammensætningen af ​​det deponerede lipid film. Dette er især vigtigt for studier af lipidmembranen fase adfærd, men kan også være kritisk for kvantitative eksperimenter på ionkanalfunktion. Baykal-Caglar et al. 'S protokol er ens, men ikke identisk med vores egne, og læserne opfordres til at studere det så godt.

Denne protokol (se oversigt, figur 1) er en af mange, der kunne anvendes. I princippet electroformation succes afhænger af lipidblanding, hydrering, temperatur, andre opløste (især ioner), ognaturligvis spænding og frekvens, der anvendes i formationen. Som electroformation bliver bedre forstået, forventer vi at forfine vores protokol mere.

Endelig er der ofte en stejl indlæringskurve i galvanoformgivning kæmpeliposomer. Vi foreslår mastering den konventionelle protokol (afsnit 1 og 4, og om nødvendigt, afsnit 5), før at lære at deponere lipider fra liposomale suspensioner (afsnit 2-5).

Protocol

1.. Deposition af lipider fra organiske opløsningsmidler: Klassisk Protocol Fjerne lipider fra opbevaring ved -20 ° C eller -80 ° C varm til RT Forsigtig:. Lipider er ekstremt hygroskopiske, og mange er følsomme for oxygen. Cover lipider i tør argon eller nitrogen gas og i alle trin minimere udsættelse for luft. Hvis det er nødvendigt, suspendere lipider i chloroform eller cyclohexan på 1-10 mg / ml, bemærk at fabrikantens anførte koncentrationer er typisk nominel…

Representative Results

I vores eksempel, forbereder vi liposomer fra en blanding af omkring 55 mol% POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin), 15 mol% POPS (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphoserin , 30 mol% kolesterol, og 0,1 mol% Texas Red-mærket 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoethanolamin (TXR-DPPE). Denne sammensætning blev valgt som ca repræsentative for Dorsalrodsganglieceller lipider 18 år. Vi konstaterer, at 15 mol% opladet lipid (her POP) er tæt på grænsen for, hvad der kan bruges…

Discussion

Electroformation af kæmpeliposomer har udviklet sig til en fleksibel teknik kompatibel med diverse lipider, præparater og buffere. Omhyggelig kontrol af lipidaflejring processen er mest kritisk for succes. Vi har præsenteret enkle værktøjer til at gøre kontrolleret aflejring af lipider fra små liposompræparater en enkel proces. Den relative fugtighed er kritisk for korrekt dehydrering af de oprindelige liposomer, og den optimale værdi vil variere med den oprindelige koncentration af opløste stoffer i liposomsu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667