Real-time Billeddannelse af heterotypisk blodplade-neutrophile interaktioner på aktiveret endotel Under vaskulær inflammation og thrombedannelse i levende mus
Summary
Her rapporterer vi en eksperimentel teknik til fluorescens intravital mikroskopi at visualisere heterotypiske blodplade-neutrophile interaktioner på aktiveret endotel under vaskulær inflammation og thrombedannelse i levende mus. Denne mikroskopisk teknologi vil være værdifuldt at undersøge den molekylære mekanisme af vaskulær sygdom og afprøve farmakologiske midler under patofysiologiske betingelser.
Abstract
Interaktion af aktiverede blodplader og leukocytter (primært neutrofiler) på det aktiverede endotel medierer thrombose og vaskulære inflammation. 1,2 I trombedannelse på stedet for arteriolær skade, blodplader adhærente til aktiveret endotel og subendotheliale matrixproteiner understøtter neutrofil rulning og adhæsion. Tre Omvendt under venular inflammatoriske tilstande, kan neutrofiler adhærente til aktiveret endotel understøtte adhæsion og akkumulering af cirkulerende blodplader. Heterotypisk blodplade-neutrofil aggregering kræver sekventielle processer af den særlige receptor-modreceptor interaktioner mellem celler. 4. Det er kendt, at aktiverede endotelceller frigiver adhæsionsmolekyler, såsom von Willebrand-faktor, og indledte blodpladeadhæsion og akkumulering under høje forskydningsbetingelser. 5. Også, aktiverede endotelceller støtte neutrophil rullende og vedhæftning ved at udtrykke selectiner end intercellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1), henholdsvis under betingelser med lav forskydning. fire Platelet P-selectin interagerer med neutrofiler til P-selectin glycoproteinligand-1 (PSGL-1), hvorved der induceres aktivering af neutrofile β2-integriner og faste adhæsion mellem to celletyper. På trods af de fremskridt inden for in vitro-forsøg, hvor heterotypiske blodplade-neutrofile interaktioner bestemt i fuldblod eller isolerede celler, 6,7 disse undersøgelser kan ikke manipulere oxidant stress forhold under vaskulær sygdom. I denne rapport, ved hjælp af fluorescens-mærkede, specifikke antistoffer mod et muse-blodplade-og neutrofil markør beskrives en detaljeret intravital mikroskopisk protokol til overvågning heterotypiske interaktioner mellem blodplader og neutrofiler til det aktiverede endotel under TNF-α-induceret inflammation eller efter laserinduceret skade i cremaster muskel mikrokar af levende mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en detaljeret protokol for real-time fluorescens intravital mikroskopi at visualisere heterotypiske blodplade-neutrofile interaktioner på aktiveret endotel under vaskulær inflammation og trombose. Tidligere blev lignende fluorescens mikroskopiske metoder rapporteret at undersøge den molekylære mekanisme for trombedannelse og vaskulær inflammation. 8,12 Da den heterotypisk celle-celle interaktion kunne være vigtigt for karokklusion på skadestedet, vil denne teknologi være et værdifuld…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra National Institutes of Health (P30 HL101302 og RO1 HL109439 til JC) og American Heart Association (SDG 5.270.005 til JC). A. Barazia blev understøttet af en T32HL007829 NIH træning tilskud.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
