Real-time Imaging der heterotypische Platelet-Neutrophilen-Interaktionen auf aktiviertem Endothel Während Vascular Entzündung und Thrombusbildung in lebenden Mäusen
Summary
Hier berichten wir über eine experimentelle Technik der Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündungen und Thrombusbildung in lebenden Mäusen sichtbar zu machen. Diese mikroskopische Technik wird wertvoll sein, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Erkrankungen zu studieren und pharmakologische Mittel unter pathophysiologischen Bedingungen zu testen.
Abstract
Wechselwirkung von aktivierten Blutplättchen und Leukozyten (hauptsächlich Neutrophile) auf der aktivierten Endothel vermittelt Thrombose und vaskuläre Entzündung. 1,2 Während Thrombusbildung an der Stelle der Verletzung arteriolären unterstützen Blutplättchen Anhänger der aktiviertes Endothel und subendothelialen Matrixproteinen neutrophilen rollenden und Haftung. 3 Umgekehrt unter venulären entzündlichen Erkrankungen können Neutrophile Anhänger der aktiviertes Endothel unterstützt Haftung und Akkumulation von zirkulierenden Blutplättchen. Heterotypische Blutplättchen-Aggregation neutrophilen erfordert sequentiellen Prozessen von den spezifischen Rezeptor-counter Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Zellen. 4 Es ist bekannt, aktivierten Endothelzellen Adhäsionsmolekülen wie von Willebrand-Faktor freizusetzen, initiiert somit Plättchenadhäsion und Akkumulation unter Hochscherbedingungen. 5 Außerdem aktivierten Endothelzellen unterstützt Neutrophilen rolling und Haftung durch die Expression Selektine eined interzellulären Adhäsionsmoleküls-1 (ICAM-1), bzw. bei niedrigen Shear-Bedingungen. 4 Platelet P-Selektin interagiert mit Neutrophilen durch P-Selektin Glykoprotein Ligand-1 (PSGL-1), dadurch Induzieren Aktivierung der neutrophilen β2 Integrinen und feste Haftung zwischen zwei Zelltypen. Trotz der Fortschritte in der in vitro-Experimenten, bei denen heterotypische Blutplättchen neutrophilen Wechselwirkungen in Vollblut oder isolierte Zellen, 6,7 ermittelt werden diese Studien nicht manipulieren kann Oxidationsmittel Stressbedingungen bei Gefäßerkrankungen. In diesem Bericht mit fluoreszenzmarkierten, spezifische Antikörper gegen eine Maus Blutplättchen und Neutrophilen-Marker beschreiben wir eine detaillierte Protokoll zu intravitalmikroskopische heterotypische Wechselwirkungen von Blutplättchen und Neutrophilen auf der aktivierten Endothelzellen während TNF-α-induzierte Entzündung oder nach laserinduzierten überwachen Verletzungen M. cremaster Mikrogefäßen von lebenden Mäusen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für Echtzeit-Fluoreszenz-Intravitalmikroskopie um heterotypische Thrombozyten-Neutrophilen-Interaktionen auf dem aktivierten Endothel während der vaskulären Entzündung und Thrombose zu visualisieren. Zuvor ähnliche fluoreszenzmikroskopische Ansätze gemeldet wurden, um die molekularen Mechanismen der Thrombusbildung und vaskuläre Entzündungen zu studieren. 8,12 Da die heterotypische Zell-Zell-Interaktion könnte für Vaso-Okklusion wichtig, an der verlet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus National Institutes of Health (P30 HL101302 und RO1 HL109439 um JC) und der American Heart Association (SDG 5270005 JC) unterstützt. A. Barazia wurde von einem T32HL007829 NIH Ausbildungsförderung unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
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