Изображений в реальном времени из гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействий на активированного эндотелия Во сосудистого воспаления и тромбообразования в живых мышей
Summary
Здесь мы сообщаем экспериментальная методика прижизненной флуоресцентной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и образование тромба в живых мышей. Это микроскопические технология будет ценным для изучения молекулярных механизмов сосудистых заболеваний и для проверки фармакологических агентов по патофизиологических условиях.
Abstract
Взаимодействие активированных тромбоцитов и лейкоцитов (в основном нейтрофилы) на активированном эндотелии посредником тромбозов и сосудистых воспаления. 1,2 Во время образования тромба в месте травмы артериол, тромбоциты приверженцем активированного эндотелия и субэндотелиального матричных протеинов поддерживает нейтрофилов качению и сцепление 3. Наоборот, под венулярного воспалительных заболеваний, нейтрофилы приверженцем активированного эндотелия может поддерживать адгезию и накопление циркулирующих тромбоцитов. Гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами агрегации требует последовательных процессов на специфический рецептор-счетчик рецепторных взаимодействий между клетками. 4 Известно, что активированные эндотелиальные клетки выделяют молекулы адгезии, таких как фактора Виллебранда, инициируя тем самым адгезии тромбоцитов и накопления в условиях высокого сдвига условиях 5. Кроме того, активированных эндотелиальных клеток нейтрофилов поддерживает качению и сцепление, выразив селектиныD молекулы межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), соответственно, в условиях низкого сдвига. 4 тромбоцитов Р-селектина взаимодействует с нейтрофилов через P-селектина гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), тем самым вызывая активацию нейтрофилов β2 интегринов и фирмы адгезии между двумя типами клеток. Несмотря на успехи в экспериментах в пробирке, в которой гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия определяются в цельной крови или изолированных клеток, 6,7 этих исследований не может манипулировать условиях окислительного стресса во сосудистыми заболеваниями. В этом докладе, с использованием флуоресцентно-меченые, специфические антитела против мыши тромбоцитов и нейтрофилов маркером, мы описываем подробные прижизненных микроскопических протокол для мониторинга гетеротипические взаимодействия тромбоцитов и нейтрофилов на активированном эндотелии во время TNF-α-индуцированного воспаления или после лазерно-индуцированной травмы в кремастер мышц микрососудов живых мышей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем подробный протокол реального времени флуоресценции прижизненной микроскопии для визуализации гетеротипические тромбоцитов нейтрофилами взаимодействия на активированном эндотелии во сосудистыми воспаление и тромбоз. Ранее подобные флуоресценции микроскопических …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при частичной поддержке грантов от Национального института здоровья (P30 HL101302 и RO1 HL109439 к JC) и Американской Ассоциации Сердца (SDG 5270005 по х). А. Barazia была поддержана NIH T32HL007829 подготовки гранта.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | |
| MgCl2 6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | 144-55-8 | |
| 0.9% NaCl Saline | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Ketamine | Hospira | 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Lloyd | ||
| Intramedic Tubing (PE 90) | BD Diagnostics | 427421 | |
| Intramedic Tubing (PE 10) | BD Diagnostics | 427401 | |
| Murine TNF-α | R&D Systems | 410-MT | |
| Dylight 488- labeled rat anti-mouse CD42b antibody | Emfret Analytics | X488 | |
| Alexa Fluor 647-conjugated anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) Antibody | BioLegend | 108418 | |
| NESLAB EX water bath/circulator | Thermo-Scientific | ||
| Olympus BX61W microscope | Olympus | ||
| TH4-100 Power | Olympus | ||
| Lambda DG-4 | Sutter | ||
| MPC-200 multi-manipulator | Sutter | ||
| ROE-200 stage controller | Sutter | ||
| C9300 high-speed camera | Hamamatsu | ||
| Intensifier | Video Scope International | ||
| Ablation Laser | Photonic Instruments, Inc. | ||
| SlideBook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations |
References
- Wagner, D. D., Frenette, P. S. The vessel wall and its interactions. Blood. 111, 5271-5281 (2008).
- Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease. J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).
- Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction. Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).
- Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation. Blood Rev. 21, 99-111 (2007).
- Chen, J., Lopez, J. A. Interactions of platelets with subendothelium and endothelium. Microcirculation. 12, 235-246 (2005).
- Konstantopoulos, K., et al. Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin. Circulation. 98, 873-882 (1998).
- Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin. Haematologica. 90, 833-839 (2005).
- Hidalgo, A., et al. Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury. Nat. Med. 15, 384-391 (2009).
- Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice. J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).
- Cho, J., et al. Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins. Blood. 120, 647-655 (2012).
- Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development. Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).
- Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse. Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).
- Barthel, S. R., et al. Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).
- Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule. The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317, 1767-1770 (2007).
- Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection. Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).
