Meten Intracellulaire Ca^{2 +} Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Summary

Intracellulaire Ca^{2 +} Dynamieken zijn erg belangrijk in spermafysiologie en Ca^{2 +}-Gevoelige fluorescente kleurstoffen vormen een veelzijdige tool om ze te bestuderen. Bevolking experimenten (fluorometrie en stopte doorstroming fluorometrie) en single cell experimenten (flowcytometrie en single cell imaging) worden gebruikt voor het volgen tijdruimtelijke [Ca^{2 +}] Veranderingen in de menselijke zaadcellen.

Abstract

Spermatozoa zijn mannelijke voortplantingscellen speciaal ontworpen om te bereiken, herkennen en fuseren met het ei. Om deze taken uit te voeren, moet zaadcellen bereid zijn een voortdurend veranderende omgeving geconfronteerd en diverse fysieke barrières te overwinnen. Omdat het in wezen transcriptioneel en translationeel stille, deze beweeglijke cellen vertrouwen diep op diverse signalerende mechanismen om zich te oriënteren en zwemmen in een gerichte manier, en te kampen met uitdagende omgevingsomstandigheden tijdens hun reis naar de eicel te vinden. Vooral Ca ^{2 +-gemedieerde} signalering is cruciaal voor meerdere sperma functies: activering van motiliteit, capacitation (een complex proces dat sperma de acrosoomreactie bereidt) en acrosoomreactie (exocytotische een gebeurtenis die sperma-ei fusie maakt). Het gebruik van fluorescente kleurstoffen intracellulaire fluctuaties van deze ionen volgen is opmerkelijk belang vanwege hun gemak van toepassing, gevoeligheid en veelzijdigheid van deteel. Met behulp van een enkele dye-loading protocol gebruiken we vier verschillende fluorometrische technieken om toezicht te houden sperma Ca ^{2 +} dynamiek. Elke techniek geeft duidelijke informatie die het mogelijk maakt ruimtelijke en / of temporele resolutie, het genereren van data zowel op enkele cel en cel-populatie niveau.

Introduction

Ca ^{2 +} is een universele tweede boodschapper van signaaltransductie in eukaryote cellen. Intracellulaire Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) neemt deel aan de regulatie van vele fundamentele fysiologische processen zowel prikkelbaar en niet-exciteerbare cellen. Het belang en de universaliteit van Ca ^{2 +} als tweede boodschapper tijdens signaaltransductie gebeurtenissen wordt afgeleid uit zijn tijdruimtelijke veelzijdigheid in de overdracht van informatie binnen de cel. Terwijl ^{Ca2 +} kan niet worden gesynthetiseerd of afgebroken in de cel, de intracellulaire concentratie ^{([Ca2 +]} _i) blijven binnen zeer enge grenzen door verschillende cellulaire mechanismen die continu buffer, sekwestreren, hokjes en / of verzamelen ^{Ca2 +.} Veranderingen in de concentratie van deze ionen kan op zeer gelokaliseerde gebieden binnen de cel ¹ en ontcijferen dergelijke schommelingen essentieel voor het verkrijgen van een deEPER begrip van (1) hun rol in de signalering mechanisme, (2) hun fysiologische betekenis, en (3) de algemene mechanismen van cell signaling. Ca ^{2 +-gemedieerde} signaaloverdracht is van bijzonder belang in spermafysiologie ^2. De beweeglijkheid van sperma is een van de belangrijkste functies voor bevruchting succes en in feite kunnen verschillende motiliteit gebreken steriliteit ^3-5 veroorzaken. Het belang van ^{Ca2 +} in flagellaire beweging sinds lang bekend ^6, maar is het mechanisme van hoe ^{Ca2 +} controleert de specifieke vorm van flagellaire buigen niet volledig begrepen.

Voordat fuseren met het ei, moet spermatozoa capacitation, een complex proces afhankelijk sperma residence in het vrouwelijke darmkanaal ondergaan. Tijdens capacitation, worden de zaadcellen membraan lipide architectuur en organisatie aangepast, voornamelijk als gevolg van cholesterol verwijdering uit de plasmamembraan. Bovendien zijn een aantal eiwitten tyrosine-fosforylated ^7. Belangrijker is dat uit capacitation er een toename in de intracellulaire pH (pH _i) en [Ca ^{2 +]} _i, en de membraanpotentiaal hyperpolariseert bij sommige species ^2. Capacitatie vindt alleen plaats in een subpopulatie van spermatozoa (20-40%), en het betrokken zijn bij al deze cellulaire veranderingen mechanismen zijn verre van duidelijk. Algemeen wordt aangenomen dat slechts een subpopulatie van capacitated zaadcellen ondergaan acrosoomreactie (AR) bij blootstelling aan fysiologische spoelen. De AR is een ^{Ca2 +-gereguleerde} geval gehouden meststof voor alle soorten bezitten een acrosome (gespecialiseerd organel met buitenste en binnenste membranen). Tijdens dit proces worden de buitenste membraan acrosomale zekeringen met plasmamembraan van het sperma, het vrijgeven van hydrolytische enzymen die het mogelijk maken de zaadcel naar de glyco-eiwit-matrix rond het ei (zona pellucida, of ZP) penetreren. De AR onthult een nieuwe fusogenic zaadcel oppervlak dat samenwerkt methet ei plasmamembraan voor de uiteindelijke fusie van beide gameten. Er zijn verschillende cellulaire liganden die induceren AR, progesteron een van de meest bestudeerde onder hen.

In dit werk presenteren we vier verschillende technieken met gebruik van een ^{Ca2 +-gevoelige} fluorescente kleurstof te meten [Ca ^{2 +]} _i veranderingen in menselijk sperma veroorzaakt door progesteron (behalve flowcytometrie, waarin wij meten de [Ca ^{2 +} ] _i verhoging geïnduceerd tijdens de in vitro capacitation proces). In dit geval gebruikten we Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), een membraan-doorlatende kleurstof met een _Kd = 325 nM. In vitro bewaakt we fluorescentie verandert als een functie van tijd met drie van de methoden, en met de vierde techniek die we gemeten fluorescentie waarde op een bepaald tijdstip. Deze verschillende benaderingen vullen elkaar aan, omdat helemaal bieden zij de ruimtelijke en temporele resolutieolution op zowel de enkele cel en cel-populatie niveau.

Cel Bevolking of Bulk Experimenten

Bulk technieken worden veel gebruikt niet alleen omdat de instrumenten die zij nodig zijn direct beschikbaar, maar ook omdat ze eenvoudig, goed ingeburgerd, en zorgen voor de middeling van de gegevens van metingen op miljoenen cellen in een enkel experiment.

Techniek # 1. Conventionele fluorometrie
Deze techniek bewaakt veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, de experimenten worden uitgevoerd in glazen cuvetten met monsterhoeveelheden van 200 tot 1.000 III. Goede menging van de toegevoegde reagentia vereist magnetisch roeren, en derhalve de temporele resolutie verkregen in de orde van seconden. De normale mobiele concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 ⁵ -10 ⁸ cellen / ml.

Techniek # 2. Gestopt Flow fluorometrie
Tzijn techniek volgt ook veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, maar de reagentia worden snel gemengd (met druk) in een opname cuvet met een zeer klein monstervolume (variërend 25-100 pl). Daarom homogenisering van reagentia onmiddellijk, waardoor een hoge temporele resolutie in de orde van milliseconden. Analyse van de verkregen fluorescentie vs tijd sporen geschikt voor het bepalen van reactiesnelheden, ophelderen van de complexiteit van het reactiemechanisme, verkrijgen van informatie over kortstondige reactietussenproducten, etc. De gemeenschappelijke cel concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 ⁵ -10 ⁷ cellen / ml.

Single Cell Experimenten

Bulk experimenten rapporteren het gemiddelde gedrag van een groot aantal cellen, maar kan een populatie vertonen vaak heterogeen kenmerken die het hoofd gezien gedurende deze soort metingen. Enkele cel technieken worden dus gebruikt om e te vullene informatie verkregen met celpopulatie experimenten.

Techniek # 3. Flowcytometrie
Ondanks het belang van de gegevens verkregen uit een cel metingen is het belangrijk om een ​​groot aantal cellen te analyseren om de onjuiste extrapolatie van celspecifieke eigenschappen om een ​​gehele populatie te voorkomen. Daarom worden high-throughput technieken voorkeur en de meest populaire methode is flowcytometrie, waarbij 10.000 cellen per conditie conventioneel geanalyseerd. Deze methode maakt multi-parametrische analyse van heterogene bevolking als het categoriseert cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing (FSC)), granulariteit (zijwaartse verstrooiing (SSC)) en fluorescentie-intensiteit (specifieke etiketteringsvoorschriften met een antilichaam, levensvatbaarheid marker, enz.) , waardoor het verstrekken van informatie over de distributie van de parameters 'voor een groep cellen. Flowcytometrie biedt direct plaats tijdsafhankelijke informatie ^8. Voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waarden are ook nuttig voor het selecteren van een poort die cellen omvat maar discrimineert celresten, stof, enz. Voor fluorescentiemetingen, negatieve en positieve controles fluorescentie moet worden opgenomen. Als meer dan een fluorescentie kanaal wordt gebruikt, moet een proces dat bekend staat als compensatie worden uitgevoerd (voor details zie http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Compensatie zorgt voor spectrale overlap discriminatie tussen fluoroforen. Flowcytometrie kan ook discriminatie van dode cellen, gewoonlijk door middel van propidium jodide kleuring.

Techniek # 4. Single Cell Imaging
Microscopie is een andere veel voorkomende methode om enkele cel gedrag te bestuderen, het is goed geschikt voor tijdsafhankelijke studies en het biedt ook ruimtelijke resolutie. Een belangrijk nadeel is dat de hoge-doorvoer analyse is nog in de kinderschoenen momenteel <sup> 9.

Protocol

In dit artikel beschrijven we het gebruik van de vier hiervoor genoemde technieken voor het meten van [Ca 2 +] i veranderingen in menselijke zaadcellen. We gebruikten progesteron een Ca2 + respons teweegbrengen, zoals vaststaat dat deze steroïden veroorzaakt een voorbijgaande [Ca 2 +] i toename spermatozoa. Vooral in menselijk sperma, progesteron activeert direct een Ca2 +-kanaal (namelijk CatSper) uitsluitend uitgedrukt in de plasmamembraan van zaadcell…

Representative Results

Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol voor sperma monstervoorbereiding door de opzwem-methode. De belangrijkste stappen voor het scheiden van beweeglijk sperma of de aanpassing van de concentratie geïllustreerd. De laatste incubatie stap wordt alleen uitgevoerd wanneer capacitation vereist. </p…

Discussion

Intracellulaire signalering is essentieel voor de meeste cellulaire activiteiten, Ca ^{2 +} is een alomtegenwoordige boodschapper die zoogdiercellen begeleidt gedurende hun gehele levensduur, van het begin bij de bevruchting, tot het einde van hun levenscyclus. In reactie op verschillende stimuli, [Ca ^{2 +]} i toeneemt, oscilleert en neemt spatio-temporele codering, worden bijgevolg diverse processen geactiveerd, gemoduleerd of beëindigd door Ca ^{2 +-gecodeerde} berichten. Intracellulaire Ca <…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml