מדידת תאיים Ca<sup> 2 +</sup> שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד
Summary
תאיים Ca<sup> 2 +</sup> דינמיקה הן חשובה מאוד בפיזיולוגיה של זרע וCa<sup> 2 +</sup> רגישים צבעי ניאון מהווים כלי תכליתי ללמוד אותם. ניסויי אוכלוסייה (fluorometry ועצר fluorometry זרימה) וניסויים תא בודדים (cytometry זרימה והדמיה תא יחידה) נמצאים בשימוש כדי לעקוב אחר מרחב ובזמן [Ca<sup> 2 +</sup>] שינויים בתאי זרע אנושיים.
Abstract
תאי זרע הם תאי הרבייה של גבר שתוכננו במיוחד כדי להגיע אליו, להכיר ופתיל עם הביצה. כדי לבצע משימות אלה, חייבים להיות מוכנים להתמודד עם תאי זרע סביבה משתנה כל הזמן ולהתגבר על כמה מחסומים פיסיים. להיות במהות התעתיק וtranslationally השקט, ניעתי התאים הללו מסתמכים עמוקות על מנגנוני איתות מגוונים להתמצא ולשחות באופן מכוון, ולהתמודד עם תנאי סביבה מאתגר במהלך מסעם למצוא את הביצה. בפרט, Ca 2 + איתות בתיווך היא מרכזית עבור מספר פונקציות זרע: הפעלה של תנועתיות, capacitation (תהליך מורכב שמכין את הזרע לתגובת acrosome) ותגובת acrosome (אירוע exocytotic המאפשר היתוך זרע ביצית). השימוש בצבעי ניאון כדי לעקוב אחר תנודות תאיות של יון זה הוא בעל חשיבות יוצאת דופן בשל קלות יישום, רגישותם, ורבגוניות של Detection. שימוש בפרוטוקול לצבוע טעינה אחת בודד אנו מנצלים ארבע טכניקות שונות כדי לעקוב אחר fluorometric זרע Ca 2 + דינמיקה. כל טכניקה מספקת מידע ייחודי המאפשר רזולוציה מרחבית ו / או זמנית, שהניבו נתונים הן בתא בודד ורמות אוכלוסיית תא.
Introduction
Ca 2 + הוא שליח שני אוניברסלי של מסלולי העברת אותות בתאים אוקריוטים. תאיים Ca 2 + (Ca 2 + I) משתתף בוויסות של תהליכים פיסיולוגיים בסיסיים רבים בתאים גם להתרגש ולא להתרגש. את החשיבות ואת האוניברסליות של Ca 2 + כשליח שני במהלך אירועי העברת אותות נגזרת מרבגוניות מרחב ובזמנה בהעברת המידע בתוך התא. בעוד Ca 2 + לא יכול להיות מסונתז דה נובו או מושפל בתוך התא, הריכוז תאי שלו ([Ca 2 +] i) נשמר בגבולות מאוד נוקשים באמצעות מנגנונים שונים הסלולר כי ברציפות חיץ, לעקל, למדר, ו / או לצבור Ca 2 +. שינויים בריכוז של יון זה יכול להתרחש באזורי נקודתי מאוד בתוך התא 1, ופענוח תנודות כאלה הוא חיוני להשגת דההבנה של ePER (1) תפקידם במנגנון האיתות, (2) המשמעות הפיזיולוגית שלהם, וכן (3) מנגנונים כלליים של איתות תא. Ca 2 + איתות בתיווך היא בעלת חשיבות מיוחדת בזרע פיזיולוגיה 2. תנועתיות זרע היא אחד מתפקידיו החשובים ביותר להצלחת הפריה, ולמעשה, כמה פגמי תנועתיות זרע יכולים לגרום לעקרות 3-5. החשיבות של Ca 2 + בתנועת flagellar כבר זמן רב מוכרת 6, עם זאת, המנגנון של כמה Ca 2 + שולט בצורה מסוימת של flagellar כיפוף אינו מובן במלואו.
לפני שהוא נדבק עם הביצה, הזרע חייב לעבור capacitation, תהליך מורכב תלוי בזרע מגורים בתוך הנקבה בדרכי. במהלך capacitation, אדריכלות השומנים של קרום הזרע והארגון משתנים, בעיקר כתוצאה מהסרת כולסטרול מקרום הפלזמה. בנוסף, כמה חלבונים טירוזין זרחןylated 7. חשוב לציין, במהלך capacitation יש עלייה ברמת חומציות תוך תאית (pH ט) וב[ Ca 2 +] אני, ופוטנציאל הממברנה hyperpolarizes בכמה מינים 2. Capacitation לוקח רק מקום בsubpopulation של זרע (20-40%), ואת המנגנונים המעורבים בכל שינויים התאיים אלה הם רחוקים מלהיות ברורים. הדעה מקובלת היא שרק subpopulation של זרע capacitated לעבור תגובת acrosome (AR) בעת חשיפה לסלילים פיסיולוגיים. AR הוא גם 2 + אירוע מוסדר Ca נדרש להפריה בכל המינים בעלי (אברון מיוחד עם קרומים חיצוניים ופנימיים) acrosome. במהלך תהליך זה את נתיכי הקרום החיצוניים acrosomal עם קרום הפלזמה של תאי הזרע, משחררים אנזימי hydrolytic המאפשרים לתא הזרע לחדור למטריצת Glyco-חלבוניים המקיפה את הביצית (מעטפת שקופה, או ZP). א.ר. גם חושף את פני השטח תא זרע fusogenic חדשים שמקיים אינטראקציה עםקרום הפלזמה הביצה להיתוך הסופי של שני תאי המין. ישנן מספר ligands הסלולרי אשר יגרום להיות AR, פרוגסטרון אחד הכי למד מהם.
בעבודה זו אנו מציגים ארבע טכניקות שונות של השימוש בצבע פלואורסצנטי 2 + רגיש Ca למדוד [Ca 2 +] אני שינויים בזרע אנושי מופעל על ידי פרוגסטרון (פרט לcytometry הזרימה, שבו אנו נמדדים [Ca 2 + ] אני מגדיל מושרה במהלך בתהליך capacitation חוץ גופית). במקרה הספציפי הזה היינו Fluo-3 בבוקר (חיים טכנולוגיות, גרנד איילנד, ניו יורק), צבע קרום חדיר עם K D = 325 ננומטר. במבחנתנו לנטר שינויי הקרינה כפונקציה של זמן עם שלוש מהשיטות, ועם הטכניקה הרביעית מדדנו ערכי הקרינה בנקודה מסוימת אחת בזמן. אלו גישות שונות משלימות זה את זה, שכן הם מספקים לגמרי מיל מרחב ובזמןolution בשניהם תא הבודד ורמות אוכלוסיית תא.
אוכלוסיית תא או ניסויים בתפזורת
טכניקות נמצאות בשימוש נרחב בכמות גדולה לא רק בגלל המכשירים שהם דורשים זמינים, אלא גם משום שהם פשוט, מבוססים היטב, ולאפשר למיצוע של מידע ממדידות שבוצעו על מיליוני תאים בניסוי יחיד.
טכניקת המס '1. Fluorometry הקונבנציונלי
טכניקה זו עוקבת אחר שינויים בקרינה כפונקציה של זמן; הניסויים מבוצעים בcuvettes זכוכית עם כרכי מדגם הנעים בין 200 ל -1,000 μl. ערבוב נכון של חומרים כימיים הוסיפו דורש ערבוב מגנטי, ולכן הפתרון הזמני שהושג הוא בסדר גודל של שניות. טווח ריכוז התא האופייני של הדגימות נותחו הוא 10 -10 5 8 תאים / מ"ל.
טכניקת המס '2. Fluorometry הזרימה נעצר
Tהטכניקה שלו גם מפקחת על שינויים בקרינה כפונקציה של זמן, אבל את ריאגנטים מעורבבים יחד במהירות (תוך שימוש בלחץ) לקובט הקלטה המכיל נפח דגימה קטן מאוד (הנע 25-100 μl). לכן, הומוגניזציה של חומרים כימיים היא מיידית, מה שמאפשר רזולוציה גבוהה זמנית בצו של אלפיות שנייה. ניתוח של עקבות הקרינה כפונקציה של זמן כתוצאה מתאים לקביעת שיעורי תגובה, הבהרת המורכבות של מנגנון התגובה, קבלת מידע על תשומות ביניים תגובה קצרות מועד, ועוד מגוון ריכוז התא המשותף של הדגימות נותחו הוא 10 5 -10 7 תאים / מ"ל.
ניסויי תא בודדים
ניסויים בתפזורת לדווח על ההתנהגות הממוצעת של מספר גדול של תאים, עם זאת, ייתכן שלעתים קרובות אוכלוסייה הטרוגנית תערוכת נכסים שהם התעלמו בסוג כזה של מדידות. טכניקות תא יחידות ובכך ישמשו כדי להשלים את המידע המתקבל בדואר עם ניסויי אוכלוסיית תא.
טכניקת המס '3. הזרימה cytometry
למרות חשיבותו של המידע הנובע ממדידות תא בודדות, חשוב לנתח מספר גדול של תאים על מנת למנוע הניפוח השגוי של נכסי תא ספציפיים לאוכלוסייה שלמה. מסיבה זו, טכניקות תפוקה גבוהה והם העדיפו את השיטה הפופולרית ביותר היא cytometry זרימה, שבו 10,000 תאים למצב מנותחים באופן קונבנציונלי. שיטה זו מאפשרת ניתוח רב פרמטרים של אוכלוסיות הטרוגניות כפי שהוא מסווג תאים על פי גודלם (פיזור קדימה (FSC)), גרעיניות (פיזור צד (SSC)) ועוצמת הקרינה (תיוג ספציפי עם נוגדן, סמן כדאיות, וכו ') , ובכך לספק מידע על ההתפלגות של הפרמטרים עבור קבוצה של תאים. cytometry הזרימה מספק מידע מיידי ולא תלוי זמן 8. קדימה וצד פיזור הערכים ARדואר גם שימושי לבחירת שער הכולל תאים אבל מפלה פסולת הסלולר, אבק, וכו 'לקבלת מדידות הקרינה, פקדי הקרינה שליליים וחיוביים גם חייב להיות כלול. אם נעשה שימוש בקרינת ערוץ אחד או יותר, תהליך המכונה פיצוי חייבת להתבצע (לפרטים ראו http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp). פיצוי מאפשר לאפליה חפיפה בין fluorophores רפאים. cytometry הזרימה גם מאפשר אפליה של תאים מתים, בדרך כלל באמצעות מכתים יודיד propidium.
טכניקת המס '4. הדמיה תא בודד
מיקרוסקופית הוא שיטה נפוצה אחרת כדי ללמוד את התנהגות תא בודד, זה מתאים גם ללימודים תלוי זמן והוא גם מספק רזולוציה מרחבית. חסרון עיקרי הוא שניתוח תפוקה גבוהה הוא רק בחיתוליו בעת הנוכחית <sעד> 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
האיתות תאית חיונית לפעילות הסלולר ביותר, Ca 2 + הוא שליח בכל מקום שמלווה את תאי יונקים לאורך כל תוחלת החיים שלהם, ממוצאם בהפריה, לסוף מחזור החיים שלהם. בתגובה לגירויים שונים, [Ca 2 +] אני מגביר, oscillates וקטן עם הקודיפיקציה מרחב ובזמן, ובהתאם, תהליכים מגוונים מופעלי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים חוזה לואיס דה לה וגה, אריקה Melchy וד"ר טאקויה Nishigaki לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-מקסיקו) (99,333 128,566 ולCT); Dirección גנרל דה Asuntos דל האישי Académico / האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של דה מקסיקו (IN202212-3 לCT).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5×5 ml |
References
- Bouschet, T., Henley, J. M. Calcium as an extracellular signalling molecule: perspectives on the Calcium Sensing Receptor in the brain. Comptes Rendus Biologies. 328, 691-700 (2005).
- Darszon, A., Nishigaki, T., Beltran, C., Trevino, C. L. Calcium channels in the development, maturation, and function of spermatozoa. Physiol. Rev. 91, 1305-1355 (2011).
- Esposito, G., et al. Mice deficient for soluble adenylyl cyclase are infertile because of a severe sperm-motility defect. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 2993-2998 (2004).
- Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, 505-510 (2009).
- Carlson, A. E., et al. Pharmacological targeting of native CatSper channels reveals a required role in maintenance of sperm hyperactivation. PLoS ONE. 4, e6844 (2009).
- Brokaw, C. J. Calcium and flagellar response during the chemotaxis of bracken spermatozoids. J. Cell. Physiol. 83, 151-158 (1974).
- Visconti, P. E., et al. Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway. Development. 121, 1139-1150 (1995).
- Svahn, H. A., van den Berg, A. Single cells or large populations. Lab on a chip. 7, 544-546 (2007).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 690-696 (2006).
- Strunker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, 382-386 (2011).
- Lishko, P., et al. The Control of Male Fertility by Spermatozoan Ion Channels. Annu. Rev. Physiol. , (2011).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. J. Biol. Chem. 264, 8179-8184 (1989).
- Kilic, F., et al. Caged progesterone: a new tool for studying rapid nongenomic actions of progesterone. Journal of the American Chemical Society. 131, 4027-4030 (2009).
- Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, 387-391 (2011).
- Xia, J., Ren, D. The BSA-induced Ca2+ influx during sperm capacitation is CATSPER channel-dependent. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 119 (2009).
- Galantino-Homer, H. L., Florman, H. M., Storey, B. T., Dobrinski, I., Kopf, G. S. Bovine sperm capacitation: assessment of phosphodiesterase activity and intracellular alkalinization on capacitation-associated protein tyrosine phosphorylation. Mol. Reprod. Dev. 67, 487-500 (2004).
- Baldi, E., et al. Intracellular calcium accumulation and responsiveness to progesterone in capacitating human spermatozoa. J. Androl. 12, 323-330 (1991).
