Medición de Ca intracelular^{2 +} Cambios en el esperma humano mediante cuatro técnicas: Fluorometría convencional, se detuvo Fluorometría Flow, citometría de flujo y Single imágenes de células

Summary

Intracelular de Ca^{2 +} Dinámicas son muy importantes en la fisiología de esperma y Ca^{2 +} Delicados tintes fluorescentes constituyen una herramienta versátil para su estudio. Experimentos Población (fluorometría y dejó de fluorometría de flujo) y los experimentos de células individuales (citometría de flujo y la imagen única célula) se utilizan para realizar un seguimiento espacio-temporal [Ca^{2 +}] Los cambios en los espermatozoides humanos.

Abstract

Los espermatozoides son las células reproductoras masculinas, especialmente diseñados para alcanzar, reconocer y fusionarse con el óvulo. Para realizar estas tareas, los espermatozoides deben estar preparados para enfrentarse a un entorno en constante cambio y superar varias barreras físicas. Siendo en esencia transcripcional y traduccional en silencio, estas células móviles dependen profundamente de diversos mecanismos de señalización para orientarse y nadar de una manera dirigida, y para lidiar con las difíciles condiciones ambientales durante su viaje para encontrar el huevo. En particular, Ca ^{2 +-señalización} mediada es fundamental para varias funciones espermáticas: la activación de la motilidad, la capacitación (un proceso complejo que se prepara esperma para la reacción del acrosoma) y la reacción acrosómica (un evento de exocitosis que permite la fusión esperma-óvulo). El uso de colorantes fluorescentes para rastrear las fluctuaciones intracelulares de este ión es de notable importancia debido a su facilidad de aplicación, la sensibilidad, y la versatilidad de detexión. Utilizando un protocolo de tinte de carga solo utilizamos cuatro técnicas diferentes para controlar fluorométricas espermatozoides Ca ^{2 +} dinámica. Cada técnica proporciona información distinta que permite la resolución espacial y / o temporal, la generación de datos tanto en una sola célula y los niveles de población de células.

Introduction

Ca ^{2 +} es un segundo mensajero universal de las vías de transducción de señales en las células eucariotas. Intracelular de Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) participa en la regulación de muchos procesos fisiológicos fundamentales tanto en células excitables y no excitables. La importancia y la universalidad de la Ca ^{2 +} como segundo mensajero en la transducción de señales se deriva de su versatilidad espacio-temporal en la transmisión de información dentro de la célula. Mientras Ca ^{2 +} no puede ser sintetizado de novo o degradada dentro de la célula, su concentración intracelular ^{([Ca2 +]} _i) se mantiene dentro de límites muy estrictos a través de diferentes mecanismos celulares que continuamente tampón, secuestrar, compartimentar, y / o acumular Ca ^{2 +.} Los cambios en la concentración de este ión se producen en áreas muy localizadas dentro de la célula ^1, y descifrar dichas fluctuaciones es esencial para la obtención de uncomprensión eper de (1) su papel en el mecanismo de señalización, (2) su importancia fisiológica, y (3) los mecanismos generales de la señalización celular. Ca ^{2 +-señalización} mediada es de particular importancia en la fisiología de esperma ^2. La motilidad del esperma es una de las funciones más importantes para el éxito de la fertilización, y de hecho, varios defectos de la motilidad del esperma puede causar esterilidad ^3-5. La importancia de Ca ^{2 +} en el movimiento flagelar se ha reconocido desde hace tiempo ^6, sin embargo, el mecanismo de cómo Ca ^{2 +} controla la forma específica de flagelar flexión no se entiende completamente.

Antes de fusionarse con el óvulo, los espermatozoides deben someterse a la capacitación, un proceso complejo que depende de la residencia de los espermatozoides dentro del tracto femenino. Durante la capacitación, la arquitectura lipídica de la membrana de los espermatozoides y la organización se modifican, principalmente como resultado de la eliminación del colesterol de la membrana plasmática. Además, varias proteínas son tirosina-fósforoylated ^7. Es importante destacar que, durante la capacitación hay un aumento en el pH intracelular (pH _i) y de la ^{[Ca2 +]} _i, y el potencial de membrana hiperpolariza en algunas especies ^2. La capacitación se lleva a cabo sólo en una subpoblación de espermatozoides (20-40%), y los mecanismos implicados en estos cambios celulares están lejos de ser clara. Se acepta generalmente que sólo una subpoblación de espermatozoides capacitados se someten a la reacción acrosómica (AR) cuando se expone a los inductores fisiológicos. La AR es también un evento de ^{2 +-Ca} regulada necesaria para la fertilización en todas las especies poseen un acrosoma (orgánulo especializado con membranas externa e interna). Durante este proceso los fusibles de membrana acrosomal exteriores con la membrana plasmática del espermatozoide, la liberación de enzimas hidrolíticas que permiten que la célula de esperma para penetrar la matriz de glico-proteico que rodea el huevo (zona pelúcida, o ZP). La AR también expone una nueva superficie de la célula de esperma fusogénico que interactúa conla membrana plasmática de huevo para la fusión final de los dos gametos. Hay varios ligandos celulares que inducen la AR, la progesterona es uno de los más estudiados entre ellos.

En este trabajo se presentan cuatro técnicas diferentes que implican el uso de un colorante fluorescente sensible a Ca ^{+ 2} para medir la [Ca ^{2 +]} _i los cambios en el esperma humano provocado por la progesterona (a excepción de la citometría de flujo, en el que se midió la [Ca ^{2 +} ] _i inducida por aumento durante el proceso de capacitación in vitro). En este caso particular, se utilizó Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), un colorante de la membrana permeable a los con una _Kd = 325 nM. In vitro que supervisó cambios de fluorescencia como una función del tiempo con tres de las metodologías, y con la cuarta técnica que mide los valores de fluorescencia en un punto dado en el tiempo. Estos diferentes enfoques se complementan entre sí, ya que en conjunto proporcionan resolución espacial y temporallución en tanto la célula individual y los niveles de población de células.

Población celular o experimentos a granel

Técnicas granel se utilizan ampliamente no sólo porque los instrumentos que requieren están fácilmente disponibles, sino también porque son simples, bien establecida, y permiten el cálculo del promedio de la información a partir de mediciones realizadas en millones de células en un solo experimento.

Técnica # 1. Fluorometría convencional
Esta técnica monitorea los cambios en la fluorescencia como una función de tiempo; los experimentos se llevan a cabo en cubetas de vidrio con volúmenes de muestra que van de 200 a 1000 l. Mezcla adecuada de los reactivos añadidos requiere agitación magnética, y por lo tanto, la resolución temporal obtenida es del orden de segundos. El intervalo de concentración celular típica de las muestras analizadas es 10 ⁵ -10 ⁸ células / ml.

Técnica # 2. Detenido Fluorometría Flow
Tsu técnica también monitorea los cambios en la fluorescencia como una función de tiempo, pero los reactivos se mezclan juntos rápidamente (utilizando la presión) en una cubeta de grabación que contiene un volumen muy pequeño de la muestra (que van de 25-100 l). Por lo tanto, la homogeneización de los reactivos es instantánea, lo que permite una alta resolución temporal en el orden de milisegundos. El análisis de la fluorescencia frente al tiempo huellas resultantes son adecuados para la determinación de las velocidades de reacción, la aclaración de la complejidad del mecanismo de reacción, la obtención de información sobre los intermedios de reacción de vida corta, etc El intervalo de concentración celular común de las muestras analizadas es 10 ⁵ -10 ⁷ células / ml.

Experimentos sola célula

Experimentos granel informan el comportamiento medio de un gran número de células, sin embargo, una población puede con frecuencia exhiben propiedades heterogéneas que se pasan por alto durante tal tipo de mediciones. Técnicas de células individuales por lo tanto se utilizan para complementar ªinformación de correo obtiene con experimentos población de células.

Técnica # 3. Citometría de Flujo
A pesar de la importancia de la información que surge a partir de mediciones de células individuales, es importante analizar un gran número de células con el fin de evitar que la extrapolación errónea de las propiedades de células específicas para una población entera. Por esta razón, las técnicas de alto rendimiento se ven favorecidos y el método más popular es la citometría de flujo, en la que 10.000 células por condición se analizan de forma convencional. Este método permite el análisis de múltiples paramétrica de poblaciones heterogéneas, ya que clasifica las células en función de su tamaño (dispersión hacia adelante (FSC)), granularidad (dispersión lateral (SSC)) y la intensidad de fluorescencia (etiquetado específico con un anticuerpo, marcador de viabilidad, etc) , lo que proporciona información sobre la distribución de los parámetros "de un grupo de células. La citometría de flujo proporciona información instantánea en lugar de en función del tiempo ^8. Adelante y lateral valores de dispersión are también es útil para la selección de una puerta que incluye células, pero discrimina los restos celulares, el polvo, etc Para las mediciones de fluorescencia, fluorescencia controles negativos y positivos también deben ser incluidos. Si se utiliza más de un canal de fluorescencia, se debe realizar un proceso conocido como compensación (para detalles ver http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Compensación permite la superposición espectral de la discriminación entre los fluoróforos. La citometría de flujo también permite la discriminación de las células muertas, generalmente por medio de tinción con yoduro de propidio.

Técnica # 4. Soltero imágenes de células
Microscopía es otro método común para estudiar el comportamiento de células individuales, sino que es muy adecuado para estudios dependientes del tiempo y también proporciona resolución espacial. Un gran inconveniente es que el análisis de alto rendimiento es sólo en su infancia en la actualidad <sa> 9.

Protocol

En este trabajo se reporta el uso de las cuatro técnicas antes mencionadas para medir la [Ca 2 +] i los cambios en los espermatozoides humanos. Se utilizó progesterona para desencadenar una respuesta de Ca 2 +, ya que está bien establecido que este esteroide produce un transitorio [Ca2 +] i aumentar en los espermatozoides. Particularmente, en el esperma humano, la progesterona activa directamente un canal de Ca2 + (es decir, CatSper) expresado exclusiv…

Representative Results

Figura 1. Diagrama esquemático del protocolo experimental para la preparación de la muestra de esperma por el método de la piscina. Los pasos principales para la separación de espermatozoides móviles y para el ajuste de su concentración se ilustran. La última etapa de incubación sólo se realiza cuando se requie…

Discussion

Señalización intracelular es vital para la mayoría de las actividades celulares; Ca ^{2 +} es un mensajero ubicuo que acompaña a las células de mamíferos a lo largo de toda su vida útil, desde su origen en la fecundación, hasta el final de su ciclo de vida. En respuesta a diferentes estímulos, [Ca ^{2 +]} i, oscila aumenta y disminuye con codificación espacio-temporal, en consecuencia, se activan diversos procesos, moduladas o terminado por Ca ^{2 +} mensajes codificados. Intracelular d…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml