Измерение внутриклеточного Са^{2 +} Изменения в человеческой спермы с помощью четырех методов: Обычные флуорометрии, остановленной струи флуорометрии, проточной цитометрии и односпальная изображений Сотовые

Summary

Внутриклеточного Са^{2 +} Динамика очень важны в сперме физиологии и Ca^{2 +} Чувствительных флуоресцентных красителей представляют собой универсальный инструмент для их изучения. Население экспериментов (флуорометрию и остановил поток флуорометрию) и разовых экспериментов клетки (проточной цитометрии и одной ячейки изображения) используются для отслеживания пространственно-временных [Ca^{2 +}] Изменения в человеческих клетках спермы.

Abstract

Сперматозоиды мужских репродуктивных клетках рассчитанным в первую очередь, признать и сливаться с яйцом. Для выполнения этих задач, сперматозоиды должны быть готовы к постоянно меняющейся окружающей среде и преодолеть несколько физических барьеров. Будучи по сути транскрипции и поступательно молчать, эти подвижные клетки глубоко полагаться на разнообразных сигнальных механизмов ориентироваться и плавать в направленном моде, и, чтобы бороться с сложных условиях окружающей среды во время их путешествия, чтобы найти яйцо. В частности, Ca ^{2 +-передачи} сигналов имеет решающее значение для нескольких функций спермы: активация моторики, капацитация (сложный процесс, который готовит спермы для акросомной реакции) и акросомной реакции (экзоцитоза событие, позволяющее спермы яйца синтеза). Использование флуоресцентных красителей для отслеживания внутриклеточных колебаний этого иона имеет значительное место из-за их легкости применения, чувствительность и универсальность Detперегиба. Использование одного красителя загрузке протокола мы используем четыре различных флуорометрическая методов для контроля спермы Ca ^{2 +} динамики. Каждый из этих методов имеет определенные информацию, которая позволяет пространственное и / или временное разрешение, генерации данных как на одну клетку и уровни клеточной популяции.

Introduction

Са ^{2 +} является универсальным вторичным мессенджером путей сигнальной трансдукции в эукариотических клетках. Внутриклеточного Са ^{2 +} (Ca ^{2 +} _I) участвует в регуляции многих фундаментальных физиологических процессов в обоих возбудимы и не возбудимых клеток. Важность и универсальность Са ^{2 +} в качестве вторичного мессенджера во время события передачи сигнала является производным от его пространственно-временной гибкость в передаче информации внутри клетки. В то время как Са ^{2 +} не могут быть синтезированы заново или деградации в клетке, его внутриклеточной концентрации ([Са ^{2 _+])} поддерживается в пределах очень строгих ограничений через различные клеточные механизмы, которые непрерывно буфер, улавливание, устроены и / или накапливать ^{Са2 +.} Изменения концентрации этого иона может происходить в сильно локализованной области в пределах ячейки ¹ и расшифровка таких колебаний имеет важное значение для получения деEPER понимание (1) их роль в сигнальный механизм, (2) их физиологическое значение, и (3) общие механизмы клеточной сигнализации. Ca ^{2 +-опосредованной} сигнализации имеет особое значение в сперме физиологии ^2. Подвижность сперматозоидов является одним из наиболее важных функций для оплодотворения успех, и в самом деле, некоторые дефекты подвижности сперматозоидов может привести к бесплодию ^3-5. Важность Ca ^{2 +} в движение жгутиковых Уже давно признано, ^6, однако механизм того, как Ca ^{2 +} контролирует специфическая форма жгутиковое изгиба до конца не изучен.

Перед сваркой с яйцом, сперматозоиды должны пройти капацитация, сложный процесс зависит от спермы резиденции внутри женского тракта. Во капацитация, липидные мембраны сперматозоидов архитектуры и организации будут изменены, в основном в результате удаления холестерина из плазмы мембраны. Кроме того, некоторые белки тирозин-фосфорylated ^7. Важно отметить, что во время капацитации происходит увеличение внутриклеточного рН _(я) и [Са ^{2 _+],} и мембранный потенциал гиперполяризует у некоторых видов ^2. Капацитация происходит только в субпопуляции сперматозоидов (20-40%), а также механизмы, участвующие во всех этих клеточных изменений, далеко не ясны. Принято считать, что только субпопуляции капаситированных спермы проходят акросомной реакции (AR) под воздействием физиологических индукторов. AR также Ca ^{2 +-регулируемых} событий необходимы для оплодотворения у всех видов обладающих акросоме (специализированные органеллы с внешней и внутренней мембраны). Во время этого процесса внешней мембраны акросомную предохранители с плазменной мембраны сперматозоидов, выпуская гидролитические ферменты, которые позволяют сперматозоидам проникнуть в глико-белковые матрицы, окружающей яйцо (пеллюцида или ZP). AR также предоставляет новые фузогенные поверхности сперматозоида, который взаимодействует смембраны плазмы яичного для окончательного слияния двух гамет. Есть несколько сотовых лигандов, которые вызывают AR, прогестерон является одним из наиболее изученных среди них.

В данной работе мы представляем четыре различные методы, связанные с использованием Са ^{2 +-чувствительного} флуоресцентного красителя для измерения [Ca ^{2 +]} _я изменения в сперме человека вызваны прогестерона (за исключением проточной цитометрии, в которых мы определили [Ca ^{2 +} ] _Я увеличить индуцированной во время процесса капацитация в пробирке). В данном случае мы использовали Fluo-3 утра (Life Technologies, Grand Island, NY), проницаемые мембраны красителя с К _D = 325 нм. Экстракорпоральное мы провели мониторинг изменений флуоресценции как функции времени с тремя из методологий, и с четвертым техники были измерены величины флуоресценции на одной данный момент времени. Эти различные подходы дополняют друг друга, так как в целом они обеспечивают пространственное и временное разрешениеOlution как на одну клетку и уровни клеточной популяции.

Клеточной популяции или массовых экспериментов

Массовые методы широко используются не только потому, что они требуют инструментов легко доступны, но и потому, что они просты, хорошо известна, и позволяют усреднение информации из измерений, проведенных на миллионов клеток в одном эксперименте.

Метод № 1. Обычные флуорометрии
Этот метод отслеживает изменения флуоресценции в зависимости от времени; Эксперименты проводились в стеклянной кюветы с образцами объемом от 200 до 1000 мкл. Правильное смешивание реагентов требуется добавить магнитной мешалкой и, следовательно, временное разрешение получено составляет порядка нескольких секунд. Типичный диапазон концентрации клеток из анализируемых образцов составляет 10 ⁵ -10 ⁸ клеток / мл.

Метод № 2. Остановленной струи флуорометрии
Tего техники также отслеживает изменения флуоресценции в зависимости от времени, но реагенты быстро смешивают вместе (с помощью давления) в запись кювету очень небольшой объем образца (в пределах от 25-100 мкл). Таким образом, гомогенизации реагентов происходит мгновенно, что позволяет высоким временным разрешением порядка миллисекунд. Анализ полученного в результате флуоресценции в зависимости от времени следы пригодны для определения скорости реакции выяснения сложность механизма реакции, получение информации о недолго промежуточных продуктов реакции и т.д. общий диапазон концентрации клеток из анализируемых образцов составляет 10 ⁵ -10 ⁷ клеток / мл.

Одноместный экспериментах с клеточными

Массовое экспериментов сообщают среднего поведение большого количества клеток, однако популяции может часто демонстрируют гетерогенные свойства, которые пропускаются в течение такого типа измерений. Одноместный Клеточные технологии при этом используются в дополнение к-йэлектронной информации, полученной с экспериментами клеточной популяции.

Метод № 3. Проточной цитометрии
Несмотря на важность информации, вытекающие из отдельных измерений клетки, важно проанализировать большое количество клеток для того, чтобы предотвратить ошибочное экстраполяции клетка-специфическими свойствами в совокупности. По этой причине высокой пропускной методами собираются в стаи и самый популярный метод проточной цитометрии, в которых 10 000 клеток на состояние условно проанализированы. Этот метод позволяет мульти-параметрического анализа гетерогенных популяций, как это классифицирует клетки в зависимости от их размера (прямого рассеяния (FSC)), детализации (бокового рассеяния (SSC)) и интенсивность флуоресценции (особая маркировка с антителом, жизнеспособность маркером и т.д.) , тем самым обеспечивая информацию о распределении параметров для группы ячеек. Проточной цитометрии обеспечивает мгновенный, а не зависящие от времени информации ^8. Вперед и в стороны разброс значений арэлектронной также полезны для выбора ворот, который включает клетки, но дискриминационным клеточных остатков, пыли и т.п. Для измерения флуоресценции, отрицательных и положительных флуоресценции управления также должны быть включены. Если более чем один флуоресценции канал используется, процесс, известный как компенсация должна быть выполнена (подробнее см. http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Компенсация позволяет спектрального перекрытия дискриминации среди флуорофорам. Проточная цитометрия также позволяет дискриминация мертвых клеток, обычно с помощью окрашивания йодистым пропидием.

Метод № 4. Одноместный изображений Сотовые
Микроскопия является еще одним распространенным методом изучения поведения одного клетки; он хорошо подходит для зависящих от времени исследований, а также обеспечивает пространственное разрешение. Основным недостатком является то, что высокопроизводительного анализа только в зачаточном состоянии в настоящее время <sдо> 9.

Protocol

В данной работе мы сообщаем об использовании четырех вышеупомянутых методов измерения [Ca 2 +] я изменения в клетках человека спермы. Мы использовали прогестерон, чтобы вызвать Са 2 + ответ, как это хорошо известно, что этот стероид производит переходные [Са 2 +]…

Representative Results

Рисунок 1. Принципиальная схема экспериментальной протокол образец спермы подготовка к которому можно подплыть методом. Основные шаги для разделения подвижных спермато?…

Discussion

Внутриклеточной сигнализации является жизненно важным для большинства сотовых деятельности; Са ^{2 +} является повсеместное посланника, который сопровождает клетках млекопитающих на протяжении всей своей жизни, от их происхождения при оплодотворении, к концу своего жизненного ци?…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml