Intracellular सीए मापने<sup> 2</supचार तकनीकों का उपयोग करते हुए मानव शुक्राणु में> परिवर्तन: परम्परागत fluorometry, फ्लो fluorometry, फ्लो और सिंगल सेल इमेजिंग रूका
Summary
Intracellular सीए<sup> 2</sup> गतिशीलता शुक्राणु शरीर विज्ञान और सीए में बहुत महत्वपूर्ण हैं<sup> 2</sup> संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक उन्हें अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण का गठन. जनसंख्या प्रयोगों (fluorometry और प्रवाह fluorometry बंद कर दिया) और एकल कक्ष प्रयोगों (प्रवाह cytometry और एकल कक्ष इमेजिंग) spatio-अस्थायी [सीए ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है<sup> 2</supमानव शुक्राणु कोशिकाओं में>] परिवर्तन.
Abstract
शुक्राणु विशेष रूप से, तक पहुंचने को समझते हैं और अंडे के साथ फ्यूज करने के लिए डिज़ाइन पुरुष प्रजनन कोशिकाओं रहे हैं. इन कार्यों को करने के लिए, शुक्राणु कोशिकाओं के एक लगातार बदलते माहौल का सामना करने के लिए और कई शारीरिक बाधाओं को दूर करने के लिए तैयार रहना चाहिए. Transcriptionally और translationally चुप सार में होने के नाते, इन गतिशील कोशिकाओं पूरबी खुद को विविध संकेतन तंत्र पर गहराई से भरोसा करते हैं और एक निर्देशित फैशन में तैरना, और अंडे खोजने के लिए अपनी यात्रा के दौरान पर्यावरण की स्थिति को चुनौती देने के साथ संघर्ष किया. विशेष रूप से, सीए 2 + की मध्यस्थता संकेत कई शुक्राणु कार्यों के लिए निर्णायक है: गतिशीलता, कैपेसिटेशन (अग्रपिण्डक प्रतिक्रिया के लिए शुक्राणु तैयार करता है कि एक जटिल प्रक्रिया) और अग्रपिण्डक प्रतिक्रिया (शुक्राणु अंडे विलय की अनुमति देता है कि एक exocytotic घटना) की सक्रियता. इस आयन के intracellular उतार चढ़ाव पर नज़र रखने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के उपयोग के आवेदन, संवेदनशीलता के अपने आसानी के कारण उल्लेखनीय महत्व का है, और डेट की चंचलताection. एक एकल डाई लोडिंग प्रोटोकॉल का उपयोग हम शुक्राणु सीए 2 + गतिशीलता की निगरानी के लिए चार अलग fluorometric तकनीकों का उपयोग. प्रत्येक तकनीक दोनों एकल कक्ष और सेल की आबादी के स्तर पर डेटा पैदा करने, स्थानिक और / या अस्थायी समाधान के लिए सक्षम बनाता है कि विशिष्ट जानकारी प्रदान करता है.
Introduction
सीए 2 + कोशिकाओं में संकेत पारगमन मार्ग की एक सार्वभौमिक दूसरा दूत है. Intracellular सीए 2 + (सीए 2 + झ) उत्तेजनीय और गैर उत्तेजनीय दोनों कक्षों में कई मौलिक शारीरिक प्रक्रियाओं के नियमन में भाग लेता है. 2 सीए का महत्व और सार्वभौमिकता + दूसरा दूत के रूप में संकेत पारगमन घटनाओं के दौरान सेल के भीतर सूचना के प्रसारण में अपनी spatio-अस्थायी बहुमुखी प्रतिभा से ली गई है. सीए 2 + डी नोवो या सेल, इसके intracellular एकाग्रता ([सीए 2 +] मैं) के भीतर अपमानित संश्लेषित नहीं किया जा सकता अलग सेलुलर लगातार बफर, पृथक, compartmentalize कि तंत्र और / के माध्यम से बहुत सख्त सीमा के भीतर बनाए रखा या 2 सीए जमा है जबकि +. इस आयन की एकाग्रता में परिवर्तन सेल 1 भीतर अत्यधिक स्थानीयकृत क्षेत्रों में पाए जाते हैं, और इस तरह के उतार चढ़ाव का गूढ़ रहस्य एक डी पाने के लिए आवश्यक है सकते हैंसंकेतन तंत्र में (1) उनकी भूमिका, (2) उनकी शारीरिक महत्व, और संकेतन सेल की (3) सामान्य तंत्र की eper समझ. सीए 2 + की मध्यस्थता संकेत शुक्राणु फिजियोलॉजी 2 में विशेष महत्व का है. शुक्राणु गतिशीलता निषेचन की सफलता के लिए सबसे महत्वपूर्ण कार्यों में से एक है, और वास्तव में, कई शुक्राणु गतिशीलता दोष बाँझपन 3-5 पैदा कर सकता है. + कशाभी आंदोलन में 2 सीए के महत्व 6 में पहचाना गया है, लेकिन, सीए 2 + कशाभी झुकने की विशिष्ट प्रपत्र पर नियंत्रण कैसे की व्यवस्था पूरी तरह से नहीं समझा गया है.
अंडे के साथ fusing पहले, शुक्राणु कैपेसिटेशन, महिला पथ के अंदर शुक्राणु निवास पर निर्भर एक जटिल प्रक्रिया से गुजरना होगा. कैपेसिटेशन के दौरान, शुक्राणु झिल्ली के लिपिड वास्तुकला और संगठन मुख्य रूप से प्लाज्मा झिल्ली से कोलेस्ट्रॉल को हटाने का एक परिणाम के रूप में, संशोधित कर रहे हैं. साथ ही, कई प्रोटीन टाइरोसीन-भास्वर हैं7 ylated. महत्वपूर्ण बात है, कैपेसिटेशन दौरान वहाँ intracellular पीएच में वृद्धि (पीएच मैं) है और में [सीए 2 +] मैं, और झिल्ली संभावित कुछ प्रजातियों 2 में hyperpolarizes. कैपेसिटेशन ही शुक्राणु (20-40%) के एक subpopulation में जगह लेता है, और इन सभी सेलुलर परिवर्तन में शामिल तंत्र स्पष्ट से दूर हैं. यह आम तौर पर शारीरिक inductors के संपर्क में जब capacitated शुक्राणु का केवल एक subpopulation अग्रपिण्डक प्रतिक्रिया (एआर) से गुजरना स्वीकार किया है कि. एआर भी (बाहरी और भीतरी झिल्ली के साथ विशेष organelle) एक अग्रपिण्डक रखने सभी प्रजातियों में निषेचन के लिए आवश्यक एक सीए 2 + विनियमित घटना है. इस प्रक्रिया के दौरान शुक्राणु के प्लाज्मा झिल्ली के साथ बाहरी acrosomal झिल्ली फ़्यूज़, शुक्राणु सेल अंडा (zona pellucida, या जिला परिषद) के आसपास के glyco-प्रोटीन मैट्रिक्स प्रवेश करने देते हैं कि hydrolytic एंजाइमों को रिहा. एआर भी साथ सूचना का आदान प्रदान एक नया fusogenic शुक्राणु कोशिका की सतह उजागरदोनों gametes के अंतिम संलयन के लिए अंडा प्लाज्मा झिल्ली. ए.आर., प्रोजेस्टेरोन सबसे अधिक उन के बीच अध्ययन से एक होने के लिए प्रेरित कि कई सेलुलर ligands के हैं.
इस काम में हम को मापने के लिए एक सीए 2 + संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई के प्रयोग को शामिल चार विभिन्न तकनीकों उपस्थित [सीए 2 +] मैं प्रोजेस्टेरोन से चालू होने वाले मानव शुक्राणु में बदलाव (हम [2 सीए मापा जिसमें प्रवाह cytometry, के लिए छोड़कर + ] मैं) इन विट्रो कैपेसिटेशन प्रक्रिया में दौरान प्रेरित वृद्धि हुई है. इस विशेष मामले में हम इस्तेमाल Fluo-3 (ए. जीवन टेक्नोलॉजीज, ग्रांड द्वीप, NY) के साथ एक झिल्ली पारगम्य डाई एक कश्मीर घ = 325 एनएम. इन विट्रो में हम तरीके से तीन के साथ समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति परिवर्तन पर नजर रखी, और चौथे तकनीक के साथ हम समय में एक भी भी बिंदु पर प्रतिदीप्ति मूल्यों मापा. कुल मिलाकर वे स्थानिक और लौकिक जोड़कर उपलब्ध कराने के बाद से इन अलग अलग दृष्टिकोण, एक दूसरे के पूरकएकल कक्ष और सेल जनसंख्या दोनों स्तरों पर olution.
सेल जनसंख्या या थोक प्रयोगों
वे अच्छी तरह से स्थापित, सरल कर रहे हैं, और एक ही प्रयोग में कोशिकाओं के लाखों लोगों पर प्रदर्शन माप से जानकारी की औसत के लिए अनुमति देते हैं क्योंकि वे आवश्यकता के साधन भी आसानी से उपलब्ध हैं, लेकिन क्योंकि थोक तकनीक बड़े पैमाने पर न केवल उपयोग किया जाता है.
तकनीक # 1. परम्परागत fluorometry
इस तकनीक को समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर नज़र रखता है, प्रयोगों 200 से 1,000 μl लेकर नमूना संस्करणों के साथ कांच cuvettes में प्रदर्शन कर रहे हैं. जोड़ा अभिकर्मकों का उचित मिश्रण चुंबकीय सरगर्मी की आवश्यकता है, और प्राप्त इसलिए अस्थायी समाधान सेकंड के क्रम में है. विश्लेषण के नमूने की ठेठ सेल एकाग्रता सीमा 10 5 -10 8 कोशिकाओं / एमएल है.
तकनीक # 2. रूका प्रवाह fluorometry
टीउनकी तकनीक भी समय के एक समारोह के रूप में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन पर नज़र रखता है, लेकिन अभिकर्मकों तेजी से एक बहुत छोटा सा नमूना मात्रा (25-100 μl से लेकर) युक्त एक रिकॉर्डिंग क्युवेट में (दबाव का प्रयोग करके) एक साथ मिश्रित कर रहे हैं. इसलिए, अभिकर्मकों के homogenization मिसे के क्रम में एक उच्च अस्थायी समाधान सक्षम करने से तात्कालिक है. परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति बनाम समय निशान का विश्लेषण विश्लेषण नमूनों की आम सेल एकाग्रता रेंज है अल्पकालिक प्रतिक्रिया मध्यवर्ती, आदि के बारे में जानकारी प्राप्त करने, प्रतिक्रिया तंत्र की जटिलता elucidating, प्रतिक्रिया दरों के निर्धारण के लिए उपयुक्त हैं 10 5 -10 7 कोशिकाओं / एमएल.
सिंगल सेल प्रयोगों
थोक प्रयोगों कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का औसत व्यवहार की रिपोर्ट है, लेकिन, एक जनसंख्या अक्सर माप के इस प्रकार के दौरान अनदेखी कर रहे हैं कि विषम गुण प्रदर्शित कर सकते हैं. सिंगल सेल तकनीक इस प्रकार वें पूरक करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंई जानकारी सेल आबादी प्रयोगों से प्राप्त की.
तकनीक # 3. फ्लो
एकल कक्ष माप से उत्पन्न होने वाली जानकारी के महत्व के बावजूद, यह एक पूरी आबादी के लिए सेल विशिष्ट गुणों की गलत एक्सट्रपलेशन को रोकने के क्रम में कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस कारण से, उच्च throughput तकनीक इष्ट हैं और सबसे लोकप्रिय विधि हालत प्रति 10,000 कोशिकाओं पारंपरिक विश्लेषण कर रहे हैं, जिसमें प्रवाह cytometry है. यह उनके आकार (आगे तितर बितर (एफएससी)), विघटन (पक्ष तितर बितर (एसएससी)) और प्रतिदीप्ति तीव्रता (एक एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट लेबलिंग, व्यवहार्यता मार्कर, आदि) के अनुसार कोशिकाओं categorizes के रूप में इस विधि विषम आबादी के मल्टी पैरामीट्रिक विश्लेषण सक्षम बनाता है , इस प्रकार की कोशिकाओं के एक समूह के लिए मापदंडों के वितरण के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं. प्रवाह cytometry बल्कि समय पर निर्भर जानकारी 8 से तत्काल प्रदान करता है. आगे और पक्ष बिखराव मूल्यों की गिरफ्तारीकोशिकाओं शामिल है, लेकिन प्रतिदीप्ति माप, नकारात्मक और सकारात्मक प्रतिदीप्ति नियंत्रण के लिए सेलुलर मलबे, धूल, आदि भेदभाव कि एक फाटक के चयन के लिए भी उपयोगी ई भी शामिल किया जाना चाहिए. एक से अधिक प्रतिदीप्ति चैनल का इस्तेमाल किया जाता है, तो मुआवजे के रूप में जाना प्रक्रिया (विवरण देखने के लिए प्रदर्शन किया जाना चाहिए http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). मुआवजा fluorophores के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप भेदभाव के लिए अनुमति देता है. प्रवाह cytometry भी propidium आयोडाइड धुंधला के माध्यम से आम तौर पर, मृत कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति देता है.
तकनीक # 4. सिंगल सेल इमेजिंग
माइक्रोस्कोपी एकल कक्ष के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक आम तरीका है, यह अच्छी तरह से समय पर निर्भर पढ़ाई के लिए अनुकूल है और यह भी स्थानिक संकल्प प्रदान करता है. एक प्रमुख दोष उच्च throughput विश्लेषण वर्तमान समय में अपनी प्रारंभिक अवस्था में ही है <s9> ऊपर.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intracellular संकेत सबसे सेलुलर गतिविधियों के लिए महत्वपूर्ण है, सीए 2 + उनके जीवन चक्र का अंत करने के लिए, निषेचन में अपने मूल से, अपने पूरे जीवन भर स्तनधारी कोशिकाओं के साथ जुडा हुआ है कि एक सर्वव्यापी दूत है…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों तकनीकी सहायता के लिए जोस लुइस डी ला वेगा, एरिका Melchy और डॉ. ताकुया Nishigaki धन्यवाद. ऑस्ट्रीया जनरल डी Asuntos डेल पर्सनल Académico / Universidad Nacional ऑटोनोमा डी मेक्सिको (सीटी IN202212-3), इस काम Consejo नैशनल डे Ciencia y TECNOLOGIA (CONACYT-मेक्सिको) (सीटी को 99333 और 128566) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F-10 | Sigma-Aldrich | N-6013 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A-7906 | |
| Calcium Chloride Dihydrate approx. 99% | Sigma-Aldrich | C-3881 | |
| Makler Counting Chamber | SEFI Medical Insruments LTD | SEF-MAKL | |
| Fluo-3 AM | Invitrogen | F-1242 | 20 vials/50 μg each |
| Ionomycin | Alomone | I-700 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P0130 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-9888 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P-3911 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium bicarbonate | JT Baker | 3506 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M-2670 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma-Aldrich | C-1016 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-3125 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| D-Glucose | JT Baker | 1906-01 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-2256 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Sodium L-lactate (aprox. 99%) | Sigma-Aldrich | L- 7022 | Reagents for human sperm medium (HSM) |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L-7011 | Component B |
| Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol) | Sigma- Aldrich | X-100 | 2.4 mM solution in water |
| Round coverslip | VWR | 48380 080 | 25 mm diameter |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | M-3634 | |
| Attofluor; Cell Chamber, for microscopy | Life technologies | A-7816 | |
| Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | 5×5 ml |
References
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