Måling Intracellulær Ca^{2 +} Endring i Menneskelig Sperm bruker Fire Teknikker: Konvensjonell fluorometri, Stoppet Flow fluorometri, flowcytometrisystemer og Single Cell Imaging

Summary

Intracellulær Ca^{2 +} Dynamikk er svært viktig i sperm fysiologi og Ca^{2 +}-Sensitive fluorescerende fargestoffer utgjør et allsidig verktøy for å studere dem. Befolkning eksperimenter (fluorometri og stoppet flyt fluorometri) og encellede eksperimenter (flowcytometri og enkelt celle imaging) brukes til å spore spatio-temporal [Ca^{2 +}] Endringer i menneskelige sædceller.

Abstract

Sædceller er mannlige kjønnsceller er spesielt konstruert for å nå, gjenkjenne og fusjonere med egg. For å utføre disse oppgavene, må sædcellene være forberedt på å møte et stadig skiftende miljø og overvinne flere fysiske barrierer. Å være i hovedsak transcriptionally og translationally stille, disse bevegelige celler stole fullt og helt om ulike signalering mekanismer å orientere seg og svømme i en rettet måte, og å stri med utfordrende miljøforhold under sin reise for å finne egget. Spesielt er Ca ^{2 +-mediert} signalisering sentral for flere sperm funksjoner: aktivering av motilitet, capacitation (en kompleks prosess som forbereder spermier for den acrosome reaksjon) og den acrosome reaksjon (exocytotic en hendelse som gjør at sæd-egg fusjon). Bruken av fluorescerende fargestoffer for å spore intracellulære svingninger av denne ion er av bemerkelsesverdig betydning på grunn av sin enkle programmet, følsomhet og allsidighet i Detection. Ved hjelp av en enkelt dye-lasting protokollen vi bruker fire forskjellige fluorometriske teknikker for å overvåke sperm Ca ^{2 +} dynamikk. Hver teknikk gir tydelig informasjon som gjør romlige og / eller tidsmessig oppløsning, generering av data både på enkelt celle og celle bestandsnivå.

Introduction

Ca ^{2 +} er en universell andre budbringer signaltransduksjonsveiene i eukaryote celler. Intracellulær ^{Ca2 +} (Ca ^{2 +} _i) deltar i reguleringen av mange grunnleggende fysiologiske prosesser i både eksiterbare og ikke-eksiterbare celler,. Betydningen og allmenn bruk av Ca ^{2 +} som andre messenger under signalformidling hendelser er avledet fra sin spatio-temporal allsidighet i overføring av informasjon i cellen. Mens Ca ^{2 +} ikke kan syntetiseres de novo eller nedbrytes inne i cellen, dets intracellulære konsentrasjon ^{([Ca2 +]} _i) holdes innenfor svært strenge grenser gjennom ulike cellulære mekanismer som kontinuerlig buffer, binder, compartmentalize, og / eller akkumuleres ^{Ca2 +.} Forandringer i konsentrasjonen av dette ion kan oppstå i sterkt lokaliserte områder inne i cellen ^1, og tolke slike svingninger er vesentlig for å oppnå en deEPER forståelse av (1) deres rolle i signalisering mekanisme, (2) deres fysiologisk betydning, og (3) de generelle mekanismer for celle-signalering. Ca ^{2 +-mediert} signalisering er av særlig betydning i sperm fysiologi ^to. Spermiemotilitet er en av de viktigste funksjonene for befruktning suksess, og i virkeligheten kan flere sperm motilitet feil føre til sterilitet ^3-5. Betydningen av Ca ^{2 +} i flagellar bevegelsen har vært lenge anerkjent ^6, men er mekanismen for hvordan Ca ^{2 +} styrer den spesifikke form av flagellar bøyning ikke fullt ut forstått.

Før den festes med egg, må sædceller gjennomgå capacitation, en kompleks prosess avhengig av sperm bolig i den kvinnelige skrift. Under capacitation, er sæden membranen lipid arkitektur og organisasjonen endres, hovedsakelig som følge av kolesterol fjernet fra plasma membran. I tillegg viste flere proteiner er tyrosin-fosforylated ^7. Viktigere, under capacitation det er en økning i intracellulær pH (pH _i) og i [Ca ^{2 +]} _i, og membranpotensialet hyperpolarizes i enkelte arter ^to. Capacitation finner bare sted i en subpopulasjon av spermatozoer (20-40%), og mekanismene som er involvert i alle disse cellulære endringer er langt fra klart. Det er generelt akseptert at bare en subpopulasjon capacitated sperm gjennomgå acrosome reaksjon (AR) når de utsettes for fysiologiske induktorer. AR er også en Ca ^{2 +-regulert} arrangement som kreves for befruktning i alle arter som innehar en acrosome (spesialiserte organeller med ytre og indre membraner). I løpet av denne prosessen de ytre acrosomal membran sikringer med sperm plasma membran, slippe hydrolytic enzymer som gjør at sædcelle å trenge inn i glyco-proteinaceous matrise rundt egget (zona pellucida, eller ZP). AR avslører også en ny fusogenic sædcelle overflate som samhandler medegget plasma membran for endelig fusjon av begge kjønnsceller. Det finnes flere mobilnettet ligander som induserer AR, progesteron være en av de mest studerte blant dem.

I dette arbeidet presenterer vi fire forskjellige teknikker som involverer bruk av en ^{Ca2 +-sensitive} fluorescerende fargestoff til å måle ^{[Ca2 +]} _i forandringer i human sperm utløst av progesteron (med unntak av strømningscytometri, der vi målt [Ca ^{2 +} ] _jeg øker indusert under in vitro capacitation prosess). I dette spesielle tilfellet har vi brukt Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), en membran som slipper gjennom fargestoff med en K _D = 325 nM. In vitro overvåket vi fluorescens endres som en funksjon av tid med tre av de metodologier og med den fjerde teknikken målte vi fluorescens-verdier ved en enkelt gitt tidspunkt. Disse ulike tilnærminger utfyller hverandre, siden de til sammen gir romlige og tidsmessige resolution på både enkelt celle og celle bestandsnivå.

Cell Befolkning eller Bulk Experiments

Bulk teknikker er mye brukt ikke bare fordi instrumentene de trenger er lett tilgjengelig, men også fordi de er enkle, godt etablert, og la for gjennomsnitt av informasjon fra målinger utført på millioner av celler i et enkelt eksperiment.

Technique # 1. Konvensjonell fluorometri
Denne teknikken overvåker endringer i fluorescens som en funksjon av tid; forsøkene er utført i glass kyvetter med prøvemengder på mellom 200 til 1000 mL. Riktig blanding av tilsatte reagenser krever magnetisk omrøring, og derfor den tidsmessig oppløsning er erholdt i størrelsesorden sekunder. Den typiske celle konsentrasjonsområde av de analyserte prøvene er 10 ⁵ -10 ⁸ celler / ml.

Technique # 2. Stoppet Flow fluorometri
Tsin teknikk overvåker også endringer i fluorescens som en funksjon av tid, men reagensene blandes raskt sammen (ved hjelp av trykk) inn i et opptak kuvette som inneholder en meget liten prøvevolum (strekker 25-100 ul). Derfor er homogenisering av reagenser momentant, slik at en høy tidsmessig oppløsning i størrelsesorden millisekunder. Analyse av de resulterende fluorescens mot tid spor er egnet for å bestemme reaksjons-hastigheter, tydeliggjøring kompleksiteten av reaksjonsmekanismen, innhenting av informasjon om kortlivede mellomprodukter reaksjonsbetingelser, etc. Den vanlige celle konsentrasjonsområde av de analyserte prøvene er 10 ⁵ -10 ⁷ celler / ml.

Enkelt celle Experiments

Bulk eksperimenter rapporterer den gjennomsnittlige oppførselen til et stort antall celler, men kan ofte utvise en populasjon heterogene egenskaper som er oversett under en slik type målinger. Encellete teknikker er dermed brukes til å utfylle the informasjon innhentet med cellepopulasjonen eksperimenter.

Technique # 3. Flowcytometrisystemer
På tross av betydningen av den informasjon som oppstår fra enkelt-celle-målinger, er det viktig å analysere et stort antall celler for å hindre feilaktige ekstrapolering av celle-spesifikke egenskaper til hele populasjonen. Av denne grunn er high-throughput teknikker foretrekkes, og de mest populære metoden er flowcytometri, hvori 10 000 celler pr tilstand blir vanligvis analysert. Denne metoden gjør det mulig for multi-parametrisk analyse av heterogene populasjoner som det kategoriserer celler i henhold til deres størrelse (forward scatter (FSC)), detaljnivå (side scatter (SSC)) og fluorescens intensitet (spesifikk merking med et antistoff, levedyktighet markør, etc.) , og dermed gi informasjon om parametre 'fordeling for en gruppe av celler. Flowcytometri gir umiddelbar snarere enn tidsavhengig informasjon ^åtte. Forward og side scatter verdier are også nyttig for å velge en gate som inneholder celler, men diskriminerer mobilnettet rusk, støv, etc. For fluorescens målinger, negative og positive fluorescens kontroller må også inkluderes. Hvis mer enn én fluorescens kanalen brukes, må en prosess som kalles kompensasjon utføres (for detaljer se http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Kompensasjon åpner for spektral overlapping diskriminering blant fluorophores. Strømningscytometri tillater også diskriminering av døde celler, vanligvis ved hjelp av propidium jodid farging.

Technique # 4. Enkelt Cell Imaging
Mikroskopi er en annen vanlig metode for å studere enkelt celle atferd, det er godt egnet for tidsavhengige studier og det gir også romlig oppløsning. En stor ulempe er at high-throughput analyser er bare i sin spede begynnelse på det nåværende tidspunkt <sopp> 9.

Protocol

I denne artikkelen rapporterer vi bruken av de fire nevnte teknikker for å måle [Ca 2 +] i endringer i menneskelige sædceller. Vi brukte progesteron for å utløse en Ca 2 + svar, som det er godt etablert at denne steroid produserer en forbigående [Ca 2 +] i økning i sædceller. Spesielt i menneskelig sperm, aktiverer progesteron direkte en Ca 2 +-kanal (nemlig CatSper) uttrykt utelukkende i plasma membran av sædceller 10,11. Vi har også…

Representative Results

Figur 1. Skisse av den eksperimentelle protokollen for sperm prøveopparbeidelse av swim-up-metoden. Den store skritt for separasjon av aktive sædceller og for justering av konsentrasjonen deres er illustrert. Den siste inkubasjonstrinn blir bare utført når capacitation er nødvendig. <p class="jove_content" fo:ke…

Discussion

Intracellulær signalering er avgjørende for de fleste cellulære aktiviteter, Ca ^{2 +} er en allestedsnærværende messenger som følger mammalieceller gjennom hele sin levetid, fra sin opprinnelse ved befruktning, til slutten av sin livssyklus. Som svar på ulike stimuli, [Ca ^{2 +]} Jeg øker, svinger og avtar med spatio-temporal kodifisering, følgelig er ulike prosesser aktivert, modulerte eller nedlegges av Ca ^{2 +-kodede} meldinger. Intracellulær Ca ^{2 +} dynamikken er svært …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Ham’s F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5×5 ml