原代培养大鼠内髓集合管细胞

Summary

精氨酸加压素（AVP）控制体内水分的动态平衡微调肾主细胞，通过促进水的重吸收。在这里，我们提出了一个协议的初级大鼠内髓集合管细胞AVP-介导的水的重吸收的分子机制的阐明适合种植。

Abstract

精氨酸加压素（AVP）肾集合管主细胞，从而微调体内水分的动态平衡，促进水的重吸收。 AVP的后叶加压素V2受体（V2R）的表面上的细胞结合，从而诱导的cAMP合成。这刺激细胞信号传导过程中的水通道蛋白2（AQP2）的磷酸化的变化。蛋白激酶A phoshorylates AQP2，从而触发细胞内的囊泡AQP2易位到质膜促进水的重吸收原尿。从主细胞垂体AVP激活的信号畸变AVP释放可引起中央或肾性尿崩症，分别升高血浆AVP水平与心血管疾病，如慢性心脏衰竭及抗利尿激素分泌综合征。

在这里，我们提出了一个协议cultivati对原代大鼠内髓集合管（IMCD）细胞，快递V2R和AQP2内源性的。这些细胞是适用于阐明的分子机制，水通道的控制，从而发现新AVP-介导的水的重吸收的失调相关的疾病的治疗的药物靶点。髓集合管细胞是从大鼠肾脏内髓质和六到八天播种后用于实验。髓集合管细胞可以定期细胞培养皿，培养瓶和不同格式的微滴定板中培养，该过程只需要几个小时，适合标准的细胞培养实验室。

Introduction

在肾集合管主细胞，精氨酸加压素（AVP）控制水的重吸收，通过刺激插入水通道蛋白2（AQP2）到质膜。 AVP结合G蛋白偶联后叶加压素2型受体（V2R），刺激腺苷酸环化酶，从而cAMP的形成。启动该信号级联激活蛋白激酶A（PKA）。蛋白激酶A磷酸化水通道在丝氨酸256（S256），这是关键的触发再分配到质膜的细胞内小泡。膜插入沿渗透压梯度和微调体内水分的动态平衡，促进水的重吸收。

失调的AVP-介导的水的重吸收，由于像差的AVP分泌或AVP-激活的的信令原因或伴有严重的疾病。水的重吸收减少V2R或AQP2突变造成的，而导致肾性尿崩症海拔血液ATED血浆AVP水平与心血管疾病，如慢性心脏衰竭及抗利尿激素分泌综合征（SIADH）水的重吸收过多。

AVP-介导的水的重吸收的意义，不仅是因为它蕴涵在疾病。 AVP诱导易位AQP2息囊泡与细胞膜的融合代表了严格cAMP依赖的胞吐过程，这是目前不是很了解。为cAMP依赖的胞吐作用的其他例子是在肾脏和H ⁺在胃中分泌的肾素分泌。因此，阐明AQP2易位肾主细胞的分子机制，不仅有助于理解相似的分子过程，在其他类型的细胞，但也可能与AVP-介导的水的重吸收障碍有关的疾病的治疗新疗法铺平道路。

êlucidating控制机制A​​QP2需要收集管主细胞模型。对于这样一些不同的哺乳动物肾细胞系都可用。然而，这些模型有几个缺点。在许多细胞系统中的水通道蛋白水平低（ 表1，M1，HEK293，COS-7，MDCK细胞^{，LLC-PK1）1-10，}其他异位过度表达人类^{（MCD4，WT10）11,12}或大鼠（CD8） ¹³ AQP2。在MCD4和COS-7细胞中的V2受体不表达。据我们所知，没有永久的细胞株作为一种模式，这是来自肾脏内髓集合管，肾AQP2表达最丰富的那部分，但是从皮质集合管^1,11,13-16 。这种细胞模型，例如广泛使用的永生mpkCCD（ 例如 ^17），或最近建立的mTERT-CCD ^14个细胞系。两种细胞系内源性表达AQP2和V2R但因为它们是来自最有可能含有皮质集合管内髓集合管（IMCD）细胞相比，不同的蛋白质组。例如，他们必须表达不同的Na ⁺的运输系统。

在这里，我们提出了一个协议文化主髓集合管细胞表达V2R和AQP2内源性。这一模式，因此，代表着最密切的生理情况在肾集合管。建立文化，只需要标准的实验室设备其他实验室可以很容易地采用这种方式。

Protocol

1。准备准备培养皿解冻胶原蛋白​​IV型O / N在4°C和0.1％无菌醋酸溶解。使用量取决于接种细胞的类型和数量的菜肴。使用2微克/厘米2。 孵育至少1小时，于RT菜肴，并用蒸馏水（A. tridest）洗两次。 允许菜肴正常干燥。 补充介质提高到500毫升培养基中添加1.75克葡萄糖，4.5 g / L的葡​​萄糖水平。为了调节介质600毫渗透摩尔，添加100mM NaCl的1…

Representative Results

原代大鼠IMCD细胞培育成功，将导致在一个融合的单层播种后6-8天（ 图2）。每60毫米培养皿中有大约6×10 6细胞。这些细胞紧紧坚持培养皿，这些被涂上IV型胶原，基底膜成分18。因此，IMCD细胞将无法分离，即使在一些彻底的洗涤程序。高达80％的培养细胞表达出来的内源性和AQP2。这是主要的细胞，，而AQP2细胞缺乏被认为是闰细胞，非髓集合管细胞是来自于薄的四肢，?…

Discussion

我们提出了一个详细的协议的准备和培养原代大鼠IMCD细胞。该方法产生高达21平方^厘米的细胞从一个大鼠^20。实验要求标准的细胞培养设备，并可以在大约6小时内由一个人进行。因此，这种做法是适合作为一个标准的实验室方法。

原代大鼠的IMCD细胞可以接种在培养皿不同大小，范围从96孔板到60毫米的菜肴。然而，环比增长384格式的程序需要优化。我们避免?…

Materials

Name	Company Catalog	Number
Collagen Type IV Mouse	BD Biosciences	356233
Hyaluronidase	SIGMA	H6254
Collagenase type CLS-II	Biochrom AG	C2-22
DMEM + GlutMAX	Invitrogen GIBCO	21885108
Nystatin	SIGMA	N4014
Ultroser G	Cytogen	15950-017
Non essential amino acids (NEA)	Biochrom AG	K0293
Gentamicin	Invitrogen GIBCO	15710
DBcAMP	BIOLOG	D009