El cultivo primarios de rata medular interna recolección de células del conducto
Summary
La arginina-vasopresina (AVP) controla la puesta a punto de la homeostasis del agua corporal facilitando la reabsorción de agua por las células principales renales. A continuación, se presenta un protocolo para el cultivo de la rata medular interna primaria recoger células de los conductos adecuados para la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a la reabsorción de agua AVP-mediada.
Abstract
La arginina-vasopresina (AVP) facilita la reabsorción de agua por la recolección de células renales principales conductos y por lo tanto un ajuste fino de la homeostasis del agua corporal. AVP se une a los receptores de vasopresina V2 (V2R) sobre la superficie de las células y por lo tanto induce la síntesis de AMPc. Esto estimula los procesos de señalización celular que conducen a cambios en la fosforilación del canal de agua acuaporina 2 (AQP2). Proteína quinasa A phoshorylates AQP2 y de ese modo provoca la translocación de AQP2 de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática facilitar la reabsorción de agua de la orina primaria. Las aberraciones de la liberación de AVP de la señalización de la pituitaria o AVP-activado en las células principales pueden causar diabetes insípida central o nefrogénica, respectivamente; un elevado nivel de sangre AVP plasmática se asocia con enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca crónica y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética.
A continuación, presentamos un protocolo para cultivatiel de la rata medular interna primaria recoger células del conducto (IMCD), que expresan V2R y AQP2 endógenamente. Las células son adecuados para elucidar los mecanismos moleculares que subyacen en el control de AQP2 y por lo tanto para descubrir nuevas dianas farmacológicas para el tratamiento de enfermedades asociadas con la disregulación de la reabsorción de agua AVP mediada. IMCD células se obtienen a partir de rata renal medullae interior y se utilizan para los experimentos de seis a ocho días después de la siembra. IMCD células pueden ser cultivadas en platos de cultivo de células regulares, matraces y placas de microtitulación de diferentes formatos, el procedimiento sólo requiere unas pocas horas, y es apropiado para laboratorios de cultivo celular estándar.
Introduction
En la recogida de las células principales de conductos renales, arginina-vasopresina (AVP) controla la reabsorción de agua mediante la estimulación de la inserción del canal de agua acuaporina 2 (AQP2) en la membrana plasmática. AVP se une a la proteína de acoplamiento de la vasopresina de tipo receptor de G-2 (V2R) estimulación de la adenilato ciclasa y por lo tanto la formación de AMPc. La iniciación de esta cascada de señalización que conduce a la activación de la proteína quinasa A (PKA). PKA fosforila AQP2 en la serina 256 (S256), que es la clave de activación para su redistribución de las vesículas intracelulares a la membrana plasmática. La inserción en la membrana facilita la reabsorción de agua a lo largo de un gradiente osmótico y un ajuste fino de la homeostasis del agua corporal.
La desregulación de la reabsorción de agua AVP-mediada, debido a las aberraciones de la secreción de AVP AVP o causas de señalización activadas por o se asocia con enfermedades graves. Disminución de la reabsorción de agua causada por mutaciones de V2R o AQP2 conduce a la diabetes insípida nefrogénica, mientras que un elevsangre ATED nivel AVP plasmática se asocia con la reabsorción de agua excesiva en las enfermedades cardiovasculares tales como la insuficiencia cardíaca crónica y el síndrome de secreción inapropiada de hormona antidiurética (SIADH).
La importancia de la reabsorción de agua AVP mediada deriva no sólo de su implicación en la enfermedad. La translocación inducida por AVP de vesículas AQP2-cojinete a y fusión con la membrana plasmática representa un proceso exocítica estrictamente dependiente de cAMP, que actualmente no se entiende bien. Otros ejemplos para una exocitosis dependiente de AMPc son la secreción de renina en el riñón y la secreción de H + en el estómago. Por lo tanto, la elucidación de los mecanismos moleculares que regulan la AQP2-translocación en células renales principales no sólo ayuda a entender los procesos moleculares similares en otros tipos de células, pero también puede allanar el camino para nuevas terapias para el tratamiento de enfermedades asociadas con trastornos de la reabsorción de agua AVP mediada .
Elucidating mecanismos AQP2 requiere el control de recogida de modelos celulares principales del conducto. Para esto un número de diferentes líneas celulares de riñón de mamífero están disponibles. Sin embargo, estos modelos tienen varios inconvenientes. En muchos sistemas de células el nivel de proteínas de AQP2 es baja (Tabla 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, otros ectópica sobreexpresan humanos (MCD4, WT10) 11,12 o de rata (CD8) 13 AQP2. En MCD4 y células COS-7 no se expresa el receptor V2. Para nuestro conocimiento no hay una línea celular permanente como un modelo disponible, que se deriva de la renal interior conducto colector medular, que parte del riñón donde AQP2 expresión es más abundante, pero desde el conducto colector cortical 1,11,13-16 . Tales modelos celulares son por ejemplo el utilizado las mTERT-CCD de 14 líneas celulares establecidas recientemente mpkCCD inmortalizado (por ejemplo 17) o. Ambas líneas celulares expresan endógenamente AQP2 y V2R, pero ya que se derivan de lostúbulo colector cortical probablemente contiene un proteoma diferente en comparación con centro medular recoger células del conducto (IMCD). Por ejemplo, se deben expresar diferentes Na + los sistemas de transporte.
A continuación, presentamos un protocolo de cultivo las células primarias que expresan IMCD V2R y AQP2 endógena. Este modelo, por lo tanto, representa más de cerca la situación fisiológica en el conducto colector renal. Como el establecimiento de la cultura requiere sólo equipo estándar de laboratorio otros laboratorios pueden adoptar fácilmente este método.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo detallado para la preparación y el cultivo de células IMCD primarios de rata. El enfoque produce hasta 21 cm 2 de las células de una rata 20. El experimento requiere un equipo de cultivo celular estándar y puede ser llevada a cabo por una sola persona dentro de aproximadamente 6 horas. Por lo tanto, este enfoque es adecuado como un método estándar de laboratorio.
Células IMCD primarios de rata se pueden sembrar en placas de cultivo de dif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL y KL 1415/3-2 1415/4-2).
Materials
| Name | Company Catalog | Number |
| Collagen Type IV Mouse | BD Biosciences | 356233 |
| Hyaluronidase | SIGMA | H6254 |
| Collagenase type CLS-II | Biochrom AG | C2-22 |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 |
| Nystatin | SIGMA | N4014 |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 |
| Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
References
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
- Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
- Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
- Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
- Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
- Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms’ tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
- Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
- Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
- Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
- Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D’Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
- Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
- Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
- Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
- Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
- Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
- Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
- Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
- Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
- Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
- Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
- Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
- Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
- Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
- Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
- Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
- Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
- Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).
