덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질
Summary
아르기닌 바소프레신 (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.
Abstract
아르기닌 바소프레신 (AVP)는 신장 덕트 주요 세포를 수집하고이를 미세 조정 몸 물 항상성에 의해 물을 재 흡수를 용이하게합니다. AVP는 세포의 표면에 바소프레신 V2 수용체 (V2R)에 결합함으로써 캠프의 합성을 유도합니다. 이 물 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2)의 인산화의 변화를 선도하는 세포 신호 전달 과정을 자극한다. 단백질 키나아제 A는 AQP2를 phoshorylates함으로써 기본 소변에서 물을 재 흡수를 촉진 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서 AQP2의 전위를 트리거합니다. 주요 세포에서 뇌하수체 또는 AVP 활성화 신호에서 AVP 방출의 수차는 각각 중앙 또는 신원 성 요붕증을 일으킬 수 있으며, 높은 혈액 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 증후군 심혈관 질환과 관련이 있습니다.
여기, 우리는 cultivati위한 프로토콜을 제시한다표현 V2R 및 AQP2는 내생 덕트 (IMCD) 세포를 수집, 차 쥐 내부 수질의합니다. 세포는 AQP2의 컨트롤을 기본 분자 메커니즘을 해명에 적합하며, 따라서 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애와 관련된 질환의 치료를위한 새로운 약물 표적을 발견 할 수 있습니다. IMCD 세포는 쥐의 신장 내 medullae에서 얻을 수 있습니다 및 6~8일 파종 후 실험에 사용됩니다. IMCD 세포는 일반 세포 배양 접시, 플라스크 및 다른 형식의 마이크로 타이 터 플레이트에서 배양 할 수있는 절차는 몇 시간이 필요하며, 표준 세포 배양 실험실에 적합합니다.
Introduction
신장 집합관 주 세포, 아르기닌 바소프레신 (AVP)는 물 삽입을 자극하여 물을 재 흡수를 제어하는 플라즈마 막에 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2). AVP는 아데 cyclase의함으로써 캠프의 형성을 자극 G 단백질 결합 바소프레신 2 형 수용체 (V2R)에 바인딩합니다. 이 신호 폭포의 개시 단백질 키나제 A (PKA)의 활성화로 연결됩니다. PKA는 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서의 재분배를위한 주요 트리거입니다, 256 (S256) 세린에서 AQP2를 인산화. 막 삽입 삼투 기울기 및 미세 조정 몸 물 항상성을 따라 물을 재 흡수를 용이하게합니다.
때문에 AVP 분비 또는 AVP 활성화 신호 원인 또는 수차에 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애는 심각한 질병과 연관됩니다. V2R 또는 AQP2의 돌연변이에 의해 발생 감소 물을 재 흡수는 표고 반면, 신원 성 요붕증로 연결ated 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 (SIADH)의 증후군 심혈관 질환의 과도한 수분 재 흡수와 연결되어 있습니다.
AVP-매개 물을 재 흡수의 중요성뿐만 아니라 질병의 의미에서 유래한다. AQP2 베어링에 소포와 세포막과 융합의 AVP 유발 전위는 현재 잘 이해되지 않는 엄격 캠프에 의존 exocytic 프로세스를 나타냅니다. 캠프 의존 exocytosis에 대한 다른 예는 신장과 H의 레닌 분비 + 위장 분비한다. 따라서 신장 주요 세포에서 AQP2-전위를 지배하는 분자 메커니즘의 해명뿐만 아니라 다른 세포 유형에 비슷한 분자 프로세스를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라 AVP-매개 물을 재 흡수의 장애와 관련된 질환의 치료에 대한 새로운 치료에 방법을 포장 수 있습니다 .
E기계 제어 AQP2를 lucidating은 덕트 주요 세포 모델을 수집해야합니다. 이를 위해 다른 포유 동물의 신장 세포 라인의 숫자를 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델은 몇 가지 단점을 가지고있다. 많은 세포 시스템에서 AQP2의 단백질 수준 (표 1, M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 낮은 1-10 ectopically 다른 과발현 사람 (MCD4, WT10) 11,12 또는 쥐 (CD8) 13 AQP2. MCD4 및 COS-7 세포에서 V2 수용체가 표시되지 않습니다. 우리의 지식이 신장 내 수질 집합관, AQP2 발현이 가장 풍부한 신장의 그 부분에서 파생 가능한 모델로 영구 세포 라인은 없지만, 대뇌 피질 집합관 1,11,13-16에서 . 이러한 세포 모델은 예를 들어 널리 사용되는 불후의 mpkCCD (예를 들어, 17) 또는 최근에 설립 된 mTERT-CCD 14 세포주이다. 두 세포주 내생 적 표현 AQP2 및 V2R 그러나 그들은에서 파생되기 때문에대뇌 피질의 수집 덕트는 대부분 덕트 (IMCD) 세포를 수집하는 내부 수질에 비해 다른 프로테옴을 포함합니다. 그들은 예를 들어 다른 나 표현해야 + 교통 시스템입니다.
여기, 우리는 V2R 및 AQP2 내생 적 표현 문화의 기본 IMCD 세포 프로토콜을 제시한다. 이 모델은, 그러므로, 신장 수집 덕트에서 가장 밀접하게 생리적 상황을 나타냅니다. 문화를 확립하는 것이 필요하기는 표준 실험실 장비 기타 실험실은 쉽게이 방법을 채택 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 차 쥐 IMCD 세포의 준비 및 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 방법은 하나의 쥐 20의 세포의 21cm 2까지 얻을 수 있습니다. 실험은 표준 세포 배양 장비가 필요하고 약 6 시간 안에 한 사람에 의해 수행 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 표준 실험 방법으로 적합합니다.
차 쥐 IMCD 세포를 96 웰 플레이트에서 60mm 요리에 이르기까지 다양한 크기의 배?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (, KL 1415/3-2와 KL 1415/4-2 DFG)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company Catalog | Number |
| Collagen Type IV Mouse | BD Biosciences | 356233 |
| Hyaluronidase | SIGMA | H6254 |
| Collagenase type CLS-II | Biochrom AG | C2-22 |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 |
| Nystatin | SIGMA | N4014 |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 |
| Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
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