Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto
Summary
Arginina-vasopressina (AVP) controlla la messa a punto del corpo omeostasi acqua facilitando il riassorbimento di acqua da parte delle cellule principali renali. Qui vi presentiamo un protocollo per la coltivazione di ratto primario midollare interna raccogliere cellule del dotto adatti per la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base di riassorbimento di acqua AVP-mediata.
Abstract
Arginina-vasopressina (AVP) facilita il riassorbimento di acqua da parte renale raccogliendo cellule principali del dotto e quindi una messa a punto del corpo omeostasi acqua. AVP si lega ai recettori V2 della vasopressina (V2R) sulla superficie delle cellule e induce quindi la sintesi di cAMP. Questo stimola processi di segnalazione cellulari che portano ai cambiamenti nella fosforilazione del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2). Proteina chinasi A phoshorylates AQP2 e innesca così la traslocazione di AQP2 da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica facilitando riassorbimento di acqua da urina primaria. Aberrazioni di AVP liberazione dalla segnalazione ipofisi o AVP-attivato nelle cellule principali possono causare il diabete insipido centrale o nefrogenica, rispettivamente, un plasma sanguigno livello AVP elevata è associata a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico.
Qui vi presentiamo un protocollo per cultivatiil ratto di primaria midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule, che esprimono V2R e AQP2 endogena. Le cellule sono adatti per chiarire i meccanismi molecolari alla base del controllo di AQP2 e quindi di scoprire nuovi bersagli farmacologici per il trattamento di malattie associate alla disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata. Cellule IMCD sono ottenuti da topo renale midollare interna e sono utilizzati per esperimenti da sei a otto giorni dopo la semina. Cellule IMCD possono essere coltivate in piatti normali di coltura cellulare, boccette e piastre micro-titolo di formati diversi, la procedura richiede solo poche ore, ed è adatto per laboratori standard di coltura cellulare.
Introduction
Nella raccolta di cellule principali del dotto renali, arginina-vasopressina (AVP) controlla il riassorbimento dell'acqua stimolando l'inserimento del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2) nella membrana plasmatica. AVP si lega alla proteina-accoppiato vasopressina di tipo-2 recettore G (V2R) stimolare ciclasi e quindi formazione di cAMP. Apertura di questa cascata di segnalazione porta all'attivazione della proteina chinasi A (PKA). PKA fosforila AQP2 a serina 256 (S256), che è la chiave di innesco per la sua ridistribuzione da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica. L'inserimento della membrana facilita il riassorbimento dell'acqua lungo un gradiente osmotico e di una messa a punto del corpo omeostasi acqua.
Disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata, a causa della secrezione di AVP aberrazioni o cause di segnalazione AVP-attivati o è associata a malattie gravi. Diminuzione del riassorbimento di acqua causata da mutazioni di V2R o AQP2 porta a diabete insipido nefrogenico, mentre un elevated livello di AVP plasma sanguigno è associato a un eccessivo riassorbimento di acqua a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico (SIADH).
Il significato di riassorbimento dell'acqua AVP-mediata deriva non solo dalla sua implicazione nella malattia. La traslocazione AVP-indotta di vescicole AQP2-cuscinetto a e la fusione con la membrana plasmatica rappresenta un processo di esocitosi strettamente cAMP-dipendente, che attualmente non è ben compreso. Altri esempi per una esocitosi cAMP-dipendente sono secrezione di renina nel rene e H + secrezione nello stomaco. Pertanto, delucidazione dei meccanismi molecolari che regolano la traslocazione-AQP2 in cellule renali principali non solo aiuta a comprendere i processi molecolari simili in altri tipi cellulari, ma può anche aprire la strada a nuove terapie per il trattamento di malattie associate a disturbi del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata .
Elucidating meccanismi AQP2 controllo richiede la raccolta modelli di cellule principali del dotto. Per questo un certo numero di differenti linee cellulari di rene di mammifero sono disponibili. Tuttavia, questi modelli hanno diversi inconvenienti. In molti sistemi di celle a livello della proteina di AQP2 è basso (Tabella 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, altri ectopicamente iperesprimono umani (MCD4, WT10) 11,12 o ratto (CD8) 13 AQP2. In MCD4 e cellule COS-7 il recettore V2 non viene espresso. A nostra conoscenza non vi è alcuna linea cellulare permanente come un modello disponibile, che è derivato dal renale midollare interna dotto collettore, la parte del rene AQP2 cui espressione è più abbondante, ma dal dotto collettore corticale 1,11,13-16 . Tali modelli cellulari sono per esempio il diffuso immortalato i mTERT-CCD 14 linee cellulari di recente istituzione mpkCCD (ad esempio 17) o. Entrambe le linee cellulari esprimono endogenamente AQP2 e V2R, ma dal momento che sono derivati daldotto collettore corticale molto probabilmente contiene un proteoma diverso rispetto a midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule. Devono per esempio esprimere diversa Na + sistemi di trasporto.
Qui vi presentiamo un protocollo per colture primarie cellule IMCD esprimono V2R e AQP2 endogeno. Questo modello, quindi, rappresenta più fedelmente la situazione fisiologica nel dotto collettore renale. Come istituisce la cultura richiede solo normali attrezzature di laboratorio altri laboratori possono facilmente adottare questo approccio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la coltura di cellule IMCD primari di ratto. L'approccio produce fino a 21 cm 2 di cellule da un ratto 20. L'esperimento richiede apparecchiatura standard coltura cellulare e può essere effettuata da una sola persona entro circa 6 ore. Pertanto, questo approccio è adatto come metodo di laboratorio standard.
Cellule IMCD primari di ratto possono essere seminate in piastre di coltura di diverse dimen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL KL 1415/3-2 e 1415/4-2).
Materials
| Name | Company Catalog | Number |
| Collagen Type IV Mouse | BD Biosciences | 356233 |
| Hyaluronidase | SIGMA | H6254 |
| Collagenase type CLS-II | Biochrom AG | C2-22 |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 |
| Nystatin | SIGMA | N4014 |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 |
| Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
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