वाहिनी कोशिकाओं का संग्रह संवर्धन प्राथमिक चूहा इनर दिमाग़ी
Summary
Arginine-वैसोप्रेसिन (एवीपी) गुर्दे की प्रमुख कोशिकाओं से पानी reabsorption की सुविधा के माध्यम से शरीर में पानी homeostasis के ठीक ट्यूनिंग नियंत्रित करता है. यहाँ, हम एवीपी की मध्यस्थता पानी reabsorption अंतर्निहित आणविक तंत्र की व्याख्या के लिए उपयुक्त वाहिनी कोशिकाओं को इकट्ठा प्राथमिक चूहा भीतरी दिमाग़ी की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Arginine-वैसोप्रेसिन (एवीपी) गुर्दे वाहिनी प्रमुख कोशिकाओं को इकट्ठा करने और इस तरह ठीक धुनों शरीर पानी समस्थिति द्वारा पानी reabsorption की सुविधा. एवीपी कोशिकाओं की सतह पर वैसोप्रेसिन V2 के रिसेप्टर्स (V2R) को बांधता है और इस तरह के शिविर का संश्लेषण लाती है. इस पानी चैनल aquaporin -2 (AQP2) की phosphorylation में परिवर्तन के लिए अग्रणी सेलुलर संकेत प्रक्रियाओं को उत्तेजित करता है. प्रोटीन kinase एक AQP2 phoshorylates और जिससे प्राथमिक मूत्र से पानी reabsorption की सुविधा प्लाज्मा झिल्ली में इंट्रासेल्युलर vesicles से AQP2 का स्थानान्तरण हो सके. प्रमुख कोशिकाओं में पिट्यूटरी या एवीपी सक्रिय संकेत से एवीपी रिहाई की aberrations क्रमश: केंद्रीय या वृक्कजनक बहुमूत्र पैदा कर सकता है, एक ऊंचा रक्त प्लाज्मा एवीपी स्तर क्रोनिक दिल विफलता और अनुचित antidiuretic हार्मोन के स्राव के सिंड्रोम के रूप में हृदय रोगों के साथ जुड़ा हुआ है.
यहाँ, हम cultivati के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुतजो व्यक्त V2R और AQP2 endogenously वाहिनी (IMCD) कोशिकाओं, एकत्रित प्राथमिक चूहा भीतरी दिमाग़ी की पर. कोशिकाओं AQP2 के नियंत्रण अंतर्निहित आणविक तंत्र elucidating के लिए उपयुक्त हैं और इस प्रकार एवीपी की मध्यस्थता पानी reabsorption का अनियंत्रण के साथ जुड़े रोगों के उपचार के लिए उपन्यास दवा लक्ष्य को खोजने के लिए. IMCD कोशिकाओं चूहे गुर्दे की भीतरी medullae से प्राप्त कर रहे हैं और छह से आठ दिनों बोने के बाद प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं. IMCD कोशिकाओं नियमित रूप से सेल संस्कृति बर्तन, बोतल और विभिन्न स्वरूपों की सूक्ष्म अनुमापांक प्लेटों में संवर्धित किया जा सकता है, प्रक्रिया में केवल कुछ घंटे की आवश्यकता है, और मानक सेल संस्कृति प्रयोगशालाओं के लिए उपयुक्त है.
Introduction
गुर्दे संग्रहण नलिका प्रिंसिपल कोशिकाओं में, आर्जिनिन-वैसोप्रेसिन (एवीपी) पानी की प्रविष्टि प्रेरक द्वारा पानी reabsorption नियंत्रित प्लाज्मा झिल्ली में चैनल aquaporin -2 (AQP2). एवीपी adenylyl साइक्लेस और इस तरह के शिविर गठन उत्तेजक जी प्रोटीन युग्मित वैसोप्रेसिन टाइप -2 रिसेप्टर (V2R) को बांधता है. इस संकेतन झरना की दीक्षा प्रोटीन kinase ए (PKA) की सक्रियता की ओर जाता है. PKA प्लाज्मा झिल्ली में इंट्रासेल्युलर vesicles से अपने पुनर्वितरण के लिए महत्वपूर्ण ट्रिगर है, जो 256 (S256) सेरीन पर AQP2 phosphorylates. झिल्ली प्रविष्टि एक आसमाटिक ढाल और ठीक धुन शरीर पानी homeostasis के साथ पानी reabsorption की सुविधा.
कारण एवीपी स्राव या एवीपी सक्रिय संकेत कारणों या की aberrations के एवीपी की मध्यस्थता पानी reabsorption का अनियंत्रण, गंभीर रोगों के साथ जुड़ा हुआ है. V2R या AQP2 के परिवर्तन की वजह से कमी आई पानी reabsorption एक elev जबकि वृक्कजनक बहुमूत्र की ओर जाता हैपैदा रक्त प्लाज्मा एवीपी स्तर क्रोनिक दिल विफलता और अनुचित antidiuretic हार्मोन स्राव (SIADH) के सिंड्रोम के रूप में हृदय रोगों में अत्यधिक पानी reabsorption के साथ जुड़ा हुआ है.
एवीपी की मध्यस्थता पानी reabsorption का महत्व न केवल रोग में इसके निहितार्थ से उपजा है. AQP2 असर को vesicles और प्लाज्मा झिल्ली के साथ विलय के एवीपी प्रेरित स्थानान्तरण वर्तमान में अच्छी तरह से नहीं समझा गया है जो एक सख्ती शिविर पर निर्भर exocytic प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है. एक शिविर पर निर्भर एक्सोसाइटोसिस के लिए अन्य उदाहरण गुर्दे और एच में रेनिन स्राव + पेट में स्राव हैं. इसलिए, गुर्दे की प्रमुख कोशिकाओं में AQP2-स्थानान्तरण गवर्निंग आणविक तंत्र की व्याख्या न केवल अन्य प्रकार की कोशिकाओं में इसी तरह के आणविक प्रक्रियाओं को समझने में मदद करता है लेकिन यह भी एवीपी की मध्यस्थता पानी reabsorption की गड़बड़ी के साथ जुड़े रोगों के उपचार के लिए उपन्यास उपचार के लिए मार्ग प्रशस्त कर सकते हैं .
एतंत्र को नियंत्रित AQP2 lucidating वाहिनी प्रमुख सेल मॉडल इकट्ठा करने की आवश्यकता है. इसके लिए विभिन्न स्तनधारी गुर्दे सेल लाइनों की एक संख्या में उपलब्ध हैं. हालांकि, इन मॉडलों में कई कमियां हैं. कई सेल प्रणाली में AQP2 के प्रोटीन का स्तर (1 टेबल, एम 1, HEK293, भंडार नियंत्रक -7, MDCK, LLC-PK1) कम है 1-10, ectopically दूसरों overexpress मानव (MCD4, WT10) 11,12 या चूहा (सीडी 8) 13 AQP2. MCD4 और COS-7 कोशिकाओं में V2 के रिसेप्टर व्यक्त नहीं कर रहा है. हमारे ज्ञान करने के लिए वहाँ गुर्दे की भीतरी दिमाग़ी संग्रहण नलिका, AQP2 अभिव्यक्ति सबसे प्रचुर मात्रा में है जहां गुर्दे के उस भाग से प्राप्त होती है, जो उपलब्ध एक मॉडल के रूप में कोई स्थायी सेल लाइन है, लेकिन कॉर्टिकल संग्रहण नलिका 1,11,13-16 से . इस तरह के सेल मॉडल उदाहरण व्यापक रूप से इस्तेमाल अमर mpkCCD (जैसे 17) या हाल ही में स्थापित mTERT सीसीडी 14 सेल लाइनों के लिए कर रहे हैं. दोनों सेल लाइनों endogenously व्यक्त AQP2 और V2R लेकिन वे से प्राप्त कर रहे हैं के बाद सेकोर्टिकल एकत्रित डक्ट सबसे अधिक संभावना वाहिनी (IMCD) कोशिकाओं को इकट्ठा करने भीतरी दिमाग़ी की तुलना में एक अलग proteome के होते हैं. वे उदाहरण के लिए अलग ना व्यक्त चाहिए + परिवहन व्यवस्था.
यहाँ, हम V2R और AQP2 endogenously व्यक्त संस्कृति प्राथमिक IMCD कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. इस मॉडल, इसलिए, गुर्दे एकत्रित डक्ट में सबसे निकट शारीरिक स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है. संस्कृति की स्थापना की आवश्यकता के रूप में केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण अन्य प्रयोगशालाओं आसानी से इस दृष्टिकोण अपनाने कर सकते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम प्राथमिक चूहा IMCD कोशिकाओं की तैयारी और संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे. दृष्टिकोण एक चूहा 20 से कोशिकाओं के 21 सेमी 2 से ऊपर पैदावार. प्रयोग मानक सेल संस्कृति उपकरणों की आवश्यकता …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (; के.एल. 1415/3-2 और के.एल. 1415/4-2 DFG) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company Catalog | Number |
| Collagen Type IV Mouse | BD Biosciences | 356233 |
| Hyaluronidase | SIGMA | H6254 |
| Collagenase type CLS-II | Biochrom AG | C2-22 |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 |
| Nystatin | SIGMA | N4014 |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 |
| Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 |
| Gentamicin | Invitrogen GIBCO | 15710 |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
References
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
- Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
- Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
- Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
- Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
- Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms’ tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
- Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
- Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
- Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
- Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D’Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
- Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
- Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
- Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
- Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
- Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
- Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
- Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
- Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
- Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
- Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
- Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
- Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
- Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
- Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
- Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
- Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
- Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).
