Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Summary

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

Abstract

Com o desejo de compreender as contribuições de múltiplos elementos celulares para o desenvolvimento de um tecido complexo, tais como os numerosos tipos de células que participam na regeneração do tecido, a formação do tumor, ou vasculogénese, concebemos um modelo de multi-colorida de transplante celular de desenvolvimento de tumores em que populações de células provenientes de diferentes camundongos gene repórter coloridas e fluorescentes são transplantadas, enxertados ou injetado e em torno de um tumor em desenvolvimento. Estas células são, então, recrutados coloridas e incorporada no estroma do tumor. Para avaliar quantitativamente derivadas da medula óssea células do estroma tumorais, nós transplantado GFP expressando transgênico medula óssea em todo RFP letalmente irradiados expressando camundongos aprovado pelo IACUC. 0ovarian tumores que foram ortotopicamente injetadas nos ratos transplantados foram excisadas 6-8 semanas pós enxerto e analisadas para o marcador de medula óssea de origem (GFP), bem como marcadores de anticorpos para detectar tumor associadoestroma usando técnicas de imagem multiespectrais. Em seguida, adaptado de uma metodologia que chamamos MIMicc-Multispectral Interrogatório de composições diversificadas celulares, usando desmistura multiespectral de fluoroprobes avaliar quantitativamente qual rotulado célula veio a partir do qual as populações iniciais (com base em rótulos originais de gene repórter), e como a nossa capacidade de unmix 4, 5 , 6 ou mais espectros por slide aumenta, nós adicionamos imunohistoquímica adicional associado com linhagens de células ou de diferenciação para aumentar a precisão. Utilizando o software para detectar sinais multiplexados fluorescente co-localizadas, as populações do estroma tumorais podem ser rastreados, enumeradas e caracterizadas com base na coloração do marcador. ¹

Introduction

Compreender o desenvolvimento e reparação dos tecidos é importante para elucidar participantes componentes celulares na cicatrização de feridas, ^2,3 medicina regenerativa, biologia do desenvolvimento e biologia do tumor. Em circunstâncias de reparação, numerosos tipos de células infiltrar o microambiente circundante para ajudar na vascularização, a deposição de ECM, a proliferação e reestruturação de tecidos. Factores celulares e fenótipos podem ser identificados com base em multiparamétrica, marcadores multiplexados que podem identificar a localização, o estado de diferenciação e a interacção entre os componentes celulares dentro do microambiente investigada. Relata-se o desenvolvimento do tumor como um exemplo prototípico para este modelo de transplante multicolor-multicelular seguido de imagens multiespectrais e metodologia desmistura espectral.

A progressão tumoral é um processo em várias etapas, que é marcada por várias capacidades adquiridas, que incluem a proliferação aumentada, umaPropriedades ntiapoptotic, invasivos e angiogénicos. ⁴ O desenvolvimento do tumor é facilitada por células não neoplásicas que são recrutadas para o ambiente circundante para fornecer factores de crescimento, as matrizes estruturais, redes vasculares e de modulação imunitária. ^1,5,6 Este microhábitat consiste de células derivadas a partir de tecidos locais, vizinhos, como adiposo e vasos sanguíneos e de fontes distantes, como medula óssea, células derivadas ^1. A extensão da incorporação de células não neoplásicas depende da demanda do tumor, o que corresponde geralmente à fase / grau do tumor. Para compreender o papel do microambiente favorável tumor, é preciso entender a origem eo potencial de diferenciação das populações de células não neoplásicas.

Este protocolo foi concebido para auxiliar a interpretação da progressão do tumor por meio da visualização de ambas as da medula óssea derivadas de componentes celulares, e o local do tecido derivcélulas ed. Utilizando camundongos fluorescentes expressando gene repórter transgênicos, nós transplantados de medula GFP (proteína verde fluorescente) osso em uma RFP letalmente irradiados (proteína vermelha fluorescente) do mouse. Seguindo o enxerto de medula óssea com êxito, uma linha de células de tumor singeneico é injectado ortotopicamente e deixou-se enxertar por 4-8 semanas. O tumor resultante é excisado do rato e processada para imunofluorescência (IF) de coloração para visualizar os componentes do estroma. Multiplexing IF marcadores é uma técnica comumente usada que envolve otimização significativa ^7-9, porém utilizando uma plataforma de imagem / desmistura multiespectral melhora o potencial de combinações de marcadores fluorescentes que possuem sobreposição espectral. Apresentamos aqui uma técnica que chamamos de interrogatório MIMicc-multiespectral de composições celulares multiplexados para manchar e analisar até oito marcadores dentro de uma seção de tumor em um único slide, a fim de analisar as origens celulares, diferenciação celular rualhos e as interações célula-célula de componentes dentro do microambiente do tumor. Este exemplo simplificado tem o potencial para ser expandida a fim de analisar cinco, seis ou mais marcadores, utilizando anticorpos ou expressão fluorescente-driven promotor intracelular. Tabela 1 apresenta potenciais combinações de coloração de anticorpos fluorescentes com espécies adequadas, tomadas em conta.

Protocol

Singênico Murino Transplante de Medula Óssea (TMO), aprovado pela protocolos IACUC institucionais (Nota: O sucesso deste protocolo requer a utilização de qualquer tipo de célula marcada (s) como alvo para análise multiespectral, e para facilitar a análise a jusante, pode-se explorar qualquer genética ou rotulagem celular estável. Sugerimos que qualquer célula, tecido ou órgão pode ser aplicado para ser de um modelo de transplante e que o transplante pode conter tantas populações únicas ro…

Representative Results

Usando uma técnica de imagem multiespectral para analisar tumores enxertados em nosso modelo de camundongo transgênico BMT, somos capazes de discernir os componentes do tumor do estroma, que são de origem medula óssea. O TMO foi confirmada inicial três semanas pós-transplante, por citometria de fluxo (Figura 1). Ortotopicamente injetado tumores ovarianos não marcados seguinte BMT confirmações de enxertia foram excisadas e fixadas em formalina seis semanas após a injeção inicial do tumor. Se?…

Discussion

Aqui nós descrevemos a aplicação de imagens multiespectrais que descrevemos como interrogatório MIMicc-multiespectral de composições celulares diversificadas, para analisar as da medula óssea componentes estromais derivadas do microambiente do tumor, porém essa metodologia e conceito pode ser aplicado a decifrar outros elementos celulares que compõem um complexo tecidos, tais como os observados durante a cicatrização de feridas ou reacções durante um tecido regenerativo. Nestas experiências que utilizam ra…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml