Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.
Con el deseo de entender las contribuciones de múltiples elementos celulares para el desarrollo de un tejido complejo; tales como los numerosos tipos de células que participan en la regeneración de tejido, la formación del tumor, o la vasculogénesis, ideamos un modelo de trasplante celular multi-color de desarrollo de tumores en que las poblaciones de células se originan de diferentes colores reportero ratones de genes con fluorescencia y se trasplantan, injertados o se inyectan en y alrededor de un tumor en desarrollo. Estas células coloreadas se reclutaron y se incorporan en el estroma tumoral. Con el fin de evaluar cuantitativamente la médula ósea células del estroma derivadas de tumores, transplantamos que expresan GFP transgénica médula ósea entera en RFP letalmente irradiados expresando ratones aprobado por el IACUC. Tumores 0ovarian que fueron inyectados ortotópicamente en los ratones transplantados fueron extirpados 6-8 semanas después del injerto y se analizaron para marcador de médula ósea de origen (GFP), así como marcadores de anticuerpos para detectar tumor asociadoestroma utilizando técnicas de imagen multiespectral. A continuación, se adaptó una metodología que llamamos MIMicc-multiespectral Interrogación de composiciones celulares multiplexados, usando desmezcla multiespectral de fluoroprobes para evaluar cuantitativamente que la etiqueta de células vino de que poblaciones de partida (basados en las etiquetas originales de gen reportero), y como nuestra capacidad para unmix 4, 5 , 6 o más espectros por aumentos de diapositivas, hemos añadido inmunohistoquímica adicional asociada con linajes celulares o diferenciación para aumentar la precisión. La utilización de software para detectar señales multiplexadas fluorescente co-localizados, las poblaciones del estroma tumoral pueden ser rastreados, enumerados y caracterizaron basándose en la tinción marcador. 1
Comprender el desarrollo de tejidos y la reparación es importante para dilucidar los componentes celulares que participan en la cicatrización de heridas, 2,3 medicina regenerativa, la biología del desarrollo y la biología del tumor. En circunstancias de reparación, numerosos tipos de células se infiltran en el microambiente que rodea a la ayuda en la vascularización, la deposición de ECM, la proliferación y la reestructuración del tejido. Factores celulares y fenotipos se pueden identificar sobre la base de multiparamétrico, marcadores multiplexados que pueden identificar la localización, estado de diferenciación y la interacción entre los componentes celulares dentro de la microambiente investigado. Aquí se describe el desarrollo del tumor como un ejemplo prototípico de este modelo de trasplante multicolor multicelular seguido de imágenes multiespectrales y la metodología desmezcla espectral.
La progresión tumoral es un proceso de varios pasos que se caracteriza por varias capacidades adquiridas que incluyen una mayor proliferación, unpropiedades ntiapoptotic, invasivos y angiogénicos. 4 Desarrollo de tumores se ve facilitada por las células no neoplásicas que son reclutados en el ambiente circundante para proporcionar factores de crecimiento, matrices estructurales, redes vasculares y la modulación inmune. 1,5,6 Este microhábitat consiste en células derivadas de tejidos locales, vecinos como adiposo y vasos sanguíneos y fuentes distantes, como la médula ósea células derivadas 1. El grado de incorporación de células no-neoplásica depende de la demanda del tumor, que a menudo corresponde con la etapa / grado del tumor. Para comprender el papel del microambiente del tumor de apoyo, hay que entender el origen y el potencial de diferenciación de las poblaciones de células no neoplásicas.
Este protocolo ha sido diseñado para ayudar en la interpretación de la progresión del tumor a través de la visualización tanto de los componentes celulares derivadas de médula ósea, y el tejido local Derivcélulas ed. Utilizando ratones transgénicos fluorescentes reportero de genes que expresan, transplantamos GFP (proteína verde fluorescente) de la médula ósea en un RFP irradiados letalmente (proteína roja fluorescente) del ratón. Después de éxito del injerto de médula ósea, una línea celular de tumor singénico se inyecta ortotópicamente y se dejó que se injertan durante 4-8 semanas. El tumor resultante se escindió del ratón y se procesaron para inmunofluorescencia (IF) y la tinción para visualizar los componentes del estroma. Multiplexación IF marcadores es una técnica de uso común que implica una optimización significativa de 7-9, sin embargo el uso de una plataforma de imágenes / desmezcla multiespectral mejora el potencial de combinaciones de marcadores fluorescentes que poseen solapamiento espectral. El presente artículo presenta una técnica que llamamos interrogatorio MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados para teñir y analizar hasta ocho marcadores dentro de una sección del tumor en una sola diapositiva con el fin de analizar los orígenes celulares, diferenciación celular stratos y las interacciones célula-célula de componentes dentro del microambiente del tumor. Este ejemplo simplificado tiene el potencial de ser ampliado a fin de analizar cinco, seis, o más marcadores que utilizan anticuerpos o expresión fluorescente promotor impulsado intracelular. Tabla 1 se enumeran las posibles combinaciones de tinción de anticuerpos fluorescentes con especies apropiadas tomadas en cuenta.
Aquí se describe la aplicación de imágenes multiespectrales que describimos como interrogación MIMicc-multiespectral de composiciones celulares multiplexados, para analizar los componentes derivados de la médula ósea del estroma de la microambiente del tumor, sin embargo esta metodología y el concepto se puede aplicar a descifrar otros elementos celulares que componen un complejo tejidos tales como los que se observan durante las reacciones de curación de heridas o durante un tejido regenerativo. En estos experi…
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos a la discusión, orientación y apoyo de los Dres. Michael Andreeff MD, PhD., Y Jared Burks PhD. Del MD Anderson Citometría de Flujo y Celular Imaging Fondo Core. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (RC1-CA146381, CA-083639, R01NS06994, CA116199 CA109451 y para la FCM. ELS también es apoyado por el Departamento de Defensa del Ejército (BC083397).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
.2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
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