تحليل الكمي متعددة الأطياف وبعد زرع الأنسجة نيون لتصور أصول الخليوي، وأنواع، والتفاعلات
Summary
الجماهير الأنسجة المعقدة، من الأجهزة للأورام، وتتكون من العناصر الخلوية المختلفة. نحن توضيح مساهمة الظواهر الخلوية داخل الأنسجة باستخدام المسمى متعدد الفئران المعدلة وراثيا الفلورسنت في تركيبة مع multiparameter تلوين مناعي تليها unmixing الطيفية فك الأصل المحمولة، فضلا عن خصائص الخلايا استنادا البروتين التعبير.
Abstract
مع الرغبة في فهم إسهامات العناصر الخلوية متعددة لتطوير الأنسجة المعقدة؛ مثل العديد من أنواع الخلايا التي تشارك في تجديد الأنسجة، وتشكيل الورم، أو تكون الأوعية، ونحن وضعت نموذجا زرع الخلوية متعددة الألوان التنمية الورم في والتي تنشأ من السكان الخلية المختلفة الملونة مراسل الفئران الجينات fluorescently ويتم زرع، أو حقن المغروسة في وحول وجود ورم النامية. ثم يتم تجنيد هذه الخلايا الملونة ودمجها في سدى الورم. من أجل إجراء تقييم كمي لنخاع العظام المستمدة خلايا انسجة الورم، ونحن زرع GFP معربا المعدلة وراثيا نخاع العظم كله في طلب تقديم العروض المشع قاتل معربا عن الفئران التي وافقت عليها IACUC. تم رفعه الأورام 0ovarian التي تم حقنها في الفئران orthotopically زرعها آخر 6-8 أسابيع engraftment وتحليلها لنخاع العظم علامة من أصل (GFP)، وكذلك الأجسام المضادة للكشف عن علامات الورم المرتبطةسدى باستخدام تقنيات التصوير متعدد الأطياف. نحن بعد ذلك تكييفها منهجية نسميه MIMicc-المتعددة الأطياف الاستجواب من تعدد التراكيب الخلوية، وذلك باستخدام unmixing متعددة الأطياف من fluoroprobes إجراء تقييم كمي والتي وصفت جاء خلية من السكان والتي تبدأ (على أساس تسميات الجين مراسل الأصلي)، وكما قدرتنا على unmix 4، 5 ، 6 أو أكثر لكل أطياف زيادات الشرائح، واضاف لدينا المناعية الإضافية المرتبطة الأنساب الخلية أو التمايز لزيادة الدقة. استخدام برامج للكشف عن إشارات المضاعفة الفلورسنت المترجمة المشترك، ويمكن إرجاع السكان انسجة الورم، وتتميز المذكورة على أساس علامة تلطيخ. 1
Introduction
فهم التنمية الأنسجة وإصلاح مهم لتوضيح المكونات الخلوية المشاركة في التئام الجروح، 2،3 الطب التجديدي، والبيولوجيا التطورية والبيولوجيا الورم. في ظل ظروف من إصلاح، والعديد من أنواع الخلايا التسلل المكروية المحيطة للمساعدة في الأوعية الدموية، ترسب ECM، وانتشار وإعادة هيكلة الأنسجة. ويمكن تحديد العوامل الخلوية والظواهر على أساس multiparameter، علامات المضاعفة التي يمكن أن تحدد توطين، وحالة التمايز والتفاعل بين المكونات الخلوية داخل المكروية التحقيق. هنا، نحن تصف تطور الورم كمثال تنميط لهذا النموذج زرع متعدد الألوان المتعددة الخلايا تليها التصوير متعدد الأطياف ومنهجية unmixing الطيفية.
ورم تطور هو عملية متعددة الخطوات التي تم وضع علامة من قبل العديد من القدرات المكتسبة التي تشمل تعزيز الانتشار، وntiapoptotic، الغازية وعائية الخصائص. مما يسهل 4 التنمية الورم عن طريق الخلايا غير الورمية التي يتم تجنيدهم في بيئة المحيطة بها لتوفير عوامل النمو، المصفوفات الهيكلية، وشبكات الأوعية الدموية والتعديل المناعي. يتكون 1،5،6 هذا موئل دقيق من الخلايا المشتقة من والأنسجة المحلية المجاورة مثل الدهنية، والأوعية الدموية ومصادر بعيدة مثل نخاع العظم الخلايا المشتقة 1. مدى دمج الخلايا غير الورمية يعتمد على الطلب من الورم، والتي تتطابق في كثير من الأحيان مع المرحلة / الصف من الورم. لفهم دور الورم المكروية داعمة، لا بد من فهم منشأ وإمكانية التفريق بين السكان الخلية غير الورمية.
وقد تم تصميم هذا البروتوكول للمساعدة في تفسير تطور الورم من خلال التصور كل من نخاع العظام المكونات الخلوية المشتقة، والاوعية الأنسجة المحليةإد الخلايا. استخدام الفلورسنت، معربا عن الجين مراسل الفئران المعدلة وراثيا، ونحن زرع نخاع GFP (الخضراء بروتين فلوري) العظام في طلب تقديم العروض المشع القاتلة (بروتين أحمر فلوري) الماوس. بعد نجاح نخاع العظم engraftment، يتم حقن الورم خط الخلية مسانج orthotopically وسمح لتدبر لمدة 4-8 أسابيع. يتم رفعه الورم الناتج عن الماوس ومعالجتها لمناعي (IF) تلطيخ لتصور مكونات اللحمية. مضاعفة IF علامات هي تقنية شائعة الاستخدام التي ينطوي كبيرة الأمثل 7-9، ومع ذلك باستخدام منصة التصوير / unmixing متعددة الأطياف يحسن القدرة على تركيبات علامة فلوري التي تمتلك التداخل الطيفي. هنا نقدم تقنية نسميه الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد في وصمة عار وتحليل ما يصل إلى ثمانية علامات داخل قسم الورم على شريحة واحدة من أجل تحليل أصول الخلوية، وتمايز الخلايا الحادي وآتوس والتفاعلات خلية خلية من المكونات داخل المكروية الورم. هذا مثال مبسط لديه القدرة على أن توسع عليها في أجل تحليل خمسة، ستة، أو أكثر علامات استخدام الأجسام المضادة أو الخلايا يحركها المروج التعبير الفلورسنت. الجدول 1 قوائم الفلورسنت تركيبات تلوين الأجسام المضادة المحتملة مع الأنواع المناسبة تؤخذ بعين الاعتبار.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وصفنا تطبيق التصوير متعدد الأطياف وصفنا كما الاستجواب MIMicc-متعددة الأطياف من التراكيب الخلوية تعدد، لتحليل نخاع العظام المستمدة من مكونات انسجة المكروية الورم، ولكن هذه المنهجية ومفهوم يمكن تطبيقها على فك رموز العناصر الخلوية الأخرى التي يتكون مجمع الأنسجة مثل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن ممتنون للمناقشات والتوجيه والدعم من الدكاترة. مايكل Andreeff دكتوراه في الطب، دكتوراه، وجاريد بوركس الدكتوراه. من MD اندرسون التدفق الخلوي والخلوية التصوير مرفق الأساسية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (RC1-CA146381، CA-083639، R01NS06994، وCA116199 CA109451 لFCM. معتمد ELS أيضا من قبل وزارة الدفاع الجيش (BC083397).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563 (2012).
- Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
- Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
- Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992 (2009).
- Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
- Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
- van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13 (2008).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).
