細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

Summary

複雑な組織塊、器官からの腫瘍に、種々の細胞成分から構成されている。我々は、タンパク質の発現に基づいて細胞起源だけでなく、電池特性を解読するスペクトルアンミキシングに続くマルチパラメータ免疫蛍光染色と組み合わせたマルチ蛍光標識トランスジェニックマウスを利用して組織内の細胞の表現型の寄与を明らかにした。

Abstract

複雑な組織の発達への複数の細胞要素の寄与を理解する欲求と、そのような多数の組織の再生に関与する細胞型、腫瘍形成、又は脈管形成などを、我々は、腫瘍発生の多色セルラ移植モデルを考案細胞集団は、異なる蛍光着色レポーター遺伝子マウスに由来し、移植された移植された又は現像腫瘍および周囲に注入される。これらの着色次いで、細胞を動員し、腫瘍間質に組み込まれる。定量的に骨髄由来の腫瘍間質細胞を評価するために、我々はIACUCによって承認されたマウスを致死的に照射RFP発現するトランスジェニック全骨髄を発現するGFPを移植した。同所移植したマウスに注射した0ovarian腫瘍移植後6〜8週間を切除し、腫瘍関連を検出するために、骨髄起源（GFP）のマーカーならびに抗体マーカーについて分析したマルチスペクトル画像化技術を使用して、間質。次に、定量的にセルがいるから（元レポーター遺伝子ラベルに基づいて）起動集団、および4、5の非混合する当社の能力として来たラベルかを評価するためにfluoroprobesのマルチスペクトルアンミキシングを使用して、我々が多重細胞組成のMIMicc – マルチスペクトル尋問呼び出す方法論を適応スライドあたりに6個以上のスペクトルは、精度を高めるために細胞系譜や分化に関連する追加の免疫組織化学を追加しました。共局在して多重化された蛍光信号を検出するためのソフトウェアを利用して、腫瘍間質集団は、トレースさ列挙マーカー染色に基づいて特徴付けすることができる^。1

Introduction

組織の発生と修復を理解することは、創傷治癒^、2,3再生医療、発生生物学および腫瘍生物学に参加して細胞成分の解明にとって重要である。修復の状況下では、多数の細胞型は、血管新生、ECM沈着、増殖および組織再構築を支援するために周囲の微小環境に浸潤する。細胞性因子および表現型マルチパラメータ、局在を同定することができる多重化マーカー、分化状態、調査微小環境内の細胞成分との相互作用に基づいて同定することができる。ここで、我々はマルチスペクトル画像化とスペクトルアンミキシング方法論が続き、この多色·多細胞移植モデルの典型例として、腫瘍発生について説明します。

腫瘍の進行は、A、増殖の増強が含まれるいくつかの買収能力によってマークされている多段階プロセスであり、、ntiapoptotic侵襲及び血管新生特性^図4腫瘍の開発は、成長因子、構造マトリックス、血管網および免疫調節を提供するために、周囲の環境中に動員される非腫瘍細胞によって促進される^。1,5,6この微小生息域は由来細胞からなる局所、隣接例えば脂肪などの組織、および血管および骨髄由来細胞^1と遠隔の供給源。非腫瘍細胞取り込みの程度は、多くの場合、腫瘍の病期/グレードに対応する腫瘍からの需要に依存している。腫瘍微小環境の支援の役割を理解するためには、非腫瘍細胞集団の起源と分化能を理解する必要があります。

このプロトコルは、細胞成分を、骨髄由来の両方の可視化を介して腫瘍の進行の解釈を助けるために設計され、局部組織DERIVされている細胞を編蛍光レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを利用して、我々は、致死的に照射RFP（赤色蛍光タンパク質）をマウスにGFP（緑色蛍光タンパク質）の骨髄を移植した。成功した骨髄移植に続いて、同系腫瘍細胞株を同所に注射し、4〜8週間のために移植するために許可されています。得られた腫瘍をマウスから切除し、間質の成分を可視化するために免疫蛍光染色（IF）のために処理される。多重マーカーIFはかなりの最適化^7-9が含まれ、一般的に使用される技術である、しかし、マルチスペクトル画像/アンミキシング·プラットフォームを使用すると、スペクトルの重なりを持った蛍光マーカーの組み合わせの可能性を向上させます。ここに我々はMIMicc – マルチスペクトルセルラー起源を分析するために染色し、単一のスライド上の腫瘍セクション内の8のマーカーまでを分析するために多重化細胞組成の尋問、細胞分化ST呼ぶ手法を提示のATUと腫瘍微小環境内の構成要素の細胞 – 細胞相互作用。この簡単な例は、抗体を利用した5つ、6つ、またはそれ以上のマーカーまたは細胞内プロモーター駆動の蛍光発現。 表1考慮する適切な種との潜在的な蛍光抗体染色の組み合わせを分析するために、上に展開される可能性を有する。

Protocol

同系マウス骨髄移植（BMT）は、制度的IACUCプロトコルによって承認された（ 注：このプロトコルの成功は、マルチスペクトル解析の対象として任意の標識細胞タイプ（S）の利用を必要とし、下流の分析を容易にするためには、任意の遺伝性を利用することができますまたは安定な細胞性標識我々は任意の細胞、組織、または器官に被移植モデルに適用した研究が有用と認める移?…

Representative Results

我々のトランスジェニックBMTマウスモデルにおいて移植された腫瘍を分析するためにマルチスペクトル画像化技術を使用して、我々は、骨髄起源である腫瘍間質成分を識別することができる。初期BMTは、フローサイトメトリー（ 図1）により、移植後三週間確認された。同所は、BMTの生着確認が最初の腫瘍注射後6週間を切除し、ホルマリンで固定し、次のラベルのない卵巣腫瘍?…

Discussion

ここに、我々は腫瘍微小環境の骨髄由来間質成分を分析するために、多重化された細胞組成物のMIMicc – マルチスペクトル尋問として記述するマルチスペクトルイメージングのアプリケーションを記述し、しかし、この方法論や概念が複雑に構成する他の細胞要素を解読に適用することができこのような創傷治癒反応中または回生組織中に​​見られるような組織。これらの実験において、我…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
			Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml