सेल मूल, प्रकार, और सहभागिता के दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट ऊतक प्रत्यारोपण के बाद मात्रात्मक Multispectral विश्लेषण
Summary
परिसर ऊतक जनता, अंगों से ट्यूमर के लिए, विभिन्न सेलुलर तत्वों से बना रहे हैं. हम सेल उत्पत्ति के साथ ही प्रोटीन अभिव्यक्ति के आधार पर सेल विशेषताओं को समझने के लिए वर्णक्रमीय unmixing द्वारा पीछा Multiparameter Immunofluorescent धुंधला के साथ संयोजन में मल्टी लेबल फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग एक ऊतक के भीतर सेलुलर phenotypes का योगदान elucidated.
Abstract
एक जटिल ऊतक के विकास के लिए कई सेलुलर तत्वों के योगदान को समझने की इच्छा के साथ, जैसे ऊतक, ट्यूमर गठन, या vasculogenesis regenerating में भाग लेने कि कई प्रकार की कोशिकाओं के रूप में, हम में ट्यूमर के विकास की एक बहुरंगी सेलुलर प्रत्यारोपण मॉडल तैयार सेल आबादी अलग fluorescently रंग रिपोर्टर जीन चूहों से ही शुरू और, प्रत्यारोपित engrafted या एक विकासशील ट्यूमर में और चारों ओर इंजेक्ट कर रहे हैं जो. ये रंग कोशिकाओं को फिर भर्ती और ट्यूमर स्ट्रोमा में शामिल कर रहे हैं. मात्रात्मक अस्थि मज्जा व्युत्पन्न ट्यूमर stromal कोशिकाओं का आकलन करने के लिए, हम IACUC द्वारा अनुमोदित के रूप में चूहों व्यक्त घातक विकिरणित आरएफपी में ट्रांसजेनिक पूरे अस्थि मज्जा व्यक्त GFP प्रतिरोपित. Orthotopically प्रत्यारोपित चूहों में इंजेक्शन थे कि 0ovarian ट्यूमर 6-8 सप्ताह के बाद engraftment excised और जुड़े ट्यूमर का पता लगाने के लिए मूल के अस्थि मज्जा मार्कर (GFP) के रूप में भी एंटीबॉडी मार्कर के लिए विश्लेषण किया गयाmultispectral इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर स्ट्रोमा. हम तो मात्रात्मक सेल, जिसमें से (मूल रिपोर्टर जीन लेबल पर आधारित) शुरू करने आबादी, और 4, 5 unmix करने की हमारी क्षमता के रूप में आया लेबल जो आकलन करने के लिए fluoroprobes के multispectral unmixing का उपयोग कर, हम मल्टिप्लेक्स सेलुलर रचनाओं की MIMicc-Multispectral पूछताछ कॉल एक पद्धति को अनुकूलित , स्लाइड बढ़ जाती 6 प्रतिशत या अधिक स्पेक्ट्रा, हम सेल प्रजातियों या परिशुद्धता बढ़ाने के लिए भेदभाव के साथ जुड़े अतिरिक्त immunohistochemistry जोड़ दिया है. सह स्थानीयकृत मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट संकेतों, ट्यूमर stromal आबादी, पता लगाया प्रगणित और मार्कर धुंधला पर आधारित होती जा सकता है पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग. 1
Introduction
ऊतकों के विकास और मरम्मत समझना घाव भरने, 2,3 पुनर्योजी चिकित्सा, विकास जीव विज्ञान और ट्यूमर जीव विज्ञान में भाग लेने सेलुलर घटकों elucidating के लिए महत्वपूर्ण है. मरम्मत की परिस्थितियों में, कई प्रकार की कोशिकाओं vascularization, ईसीएम बयान, प्रसार और ऊतक पुनर्गठन में सहायता करने के लिए आसपास के microenvironment घुसपैठ. सेलुलर कारकों और phenotypes Multiparameter, स्थानीयकरण की पहचान कर सकते हैं कि मल्टिप्लेक्स मार्कर, भेदभाव की स्थिति और जांच की microenvironment भीतर सेलुलर घटकों के बीच बातचीत के आधार पर पहचाना जा सकता है. इस के साथ साथ, हम multispectral इमेजिंग और वर्णक्रमीय unmixing पद्धति द्वारा पीछा इस बहुरंगा-बहुकोशिकीय प्रत्यारोपण मॉडल के लिए एक प्रोटोटाइप उदाहरण के रूप में ट्यूमर के विकास का वर्णन.
ट्यूमर प्रगति बढ़ाया प्रसार, एक भी शामिल है कि कई का अधिग्रहण क्षमताओं द्वारा चिह्नित है कि एक multistep प्रक्रिया है, ntiapoptotic आक्रामक और वाहिकाजनक गुण. 4 ट्यूमर के विकास वृद्धि कारकों, संरचनात्मक matrices, संवहनी नेटवर्क और प्रतिरक्षा मॉडुलन प्रदान करने के लिए आसपास के वातावरण में भर्ती कर रहे हैं कि गैर neoplastic कोशिकाओं से मदद की है. 1,5,6 इस microhabitat से ली गई कोशिकाओं के होते हैं स्थानीय, पड़ोसी ऐसी वसा के रूप में ऊतकों, और रक्त वाहिकाओं और ऐसे अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं 1 के रूप में दूर के स्रोतों. गैर neoplastic सेल समावेश की हद तक अक्सर ट्यूमर के चरण / ग्रेड के साथ मेल खाती है जो ट्यूमर, से मांग पर निर्भर करता है. ट्यूमर सहायक microenvironment की भूमिका को समझने के लिए, एक गैर neoplastic सेल आबादी की उत्पत्ति और भेदभाव की क्षमता को समझना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल स्थानीय ऊतक deriv दोनों अस्थि मज्जा व्युत्पन्न सेलुलर घटकों के दृश्य के माध्यम से ट्यूमर प्रगति की व्याख्या करने में सहायता करने के लिए डिजाइन किया गया है,कोशिकाओं एड. फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग, हम एक घातक विकिरणित आरएफपी (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) माउस में GFP (हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) अस्थि मज्जा प्रतिरोपित. सफल अस्थि मज्जा engraftment के बाद, एक syngeneic ट्यूमर कोशिका लाइन orthotopically इंजेक्शन और 4-8 सप्ताह के लिए टीका लगाना करने की अनुमति दी है. जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर माउस से excised और stromal घटकों कल्पना करने के लिए धुंधला Immunofluorescent (यदि) के लिए कार्रवाई की है. बहुसंकेतन मार्करों हालांकि वर्णक्रमीय ओवरलैप है कि अधिकारी फ्लोरोसेंट मार्कर संयोजन के लिए संभावित बेहतर बनाता है एक multispectral इमेजिंग / unmixing मंच का उपयोग कर, महत्वपूर्ण अनुकूलन 7-9 शामिल है कि आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीक है. इस के साथ साथ हम हम सेलुलर मूल, सेलुलर भेदभाव सेंट का विश्लेषण करने के क्रम में दाग और एक एकल स्लाइड पर एक ट्यूमर अनुभाग के भीतर आठ मार्करों के लिए ऊपर का विश्लेषण करने के लिए मल्टिप्लेक्स सेलुलर रचनाओं की MIMicc-multispectral पूछताछ कॉल एक तकनीक पेशatus और ट्यूमर microenvironment भीतर घटकों के सेल सेल बातचीत. इस सरल उदाहरण एंटीबॉडी के उपयोग के पांच, छह, या अधिक मार्कर या intracellular प्रमोटर संचालित फ्लोरोसेंट अभिव्यक्ति. तालिका 1 सूचियों को ध्यान में रखा उपयुक्त प्रजातियों के साथ संभावित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी धुंधला संयोजन का विश्लेषण करने के क्रम में पर विस्तार होने की संभावना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ हम हम ट्यूमर microenvironment की अस्थि मज्जा व्युत्पन्न stromal घटकों का विश्लेषण करने के लिए, मल्टिप्लेक्स सेलुलर रचनाओं की MIMicc-multispectral पूछताछ के रूप में वर्णन multispectral इमेजिंग के आवेदन का वर्णन है, लेकिन इस पद…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस से विचार विमर्श, मार्गदर्शन और समर्थन के लिए आभारी हैं. माइकल Andreeff एमडी, पीएचडी., और जारेड Burks पीएचडी. एमडी एंडरसन फ्लो और सेलुलर इमेजिंग कोर सुविधा से. इस काम FCM के लिए राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (RC1-CA146381, सीए 083639, R01NS06994, CA116199 और CA109451 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. एल्स भी रक्षा की सेना विभाग (BC083397) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
| .2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
| 10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
| 50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
| BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
| Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
| CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
| Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
| Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
| GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|
|||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Kidd, S., et al. Origins of the tumor microenvironment: quantitative assessment of adipose-derived and bone marrow-derived stroma. PLoS ONE. 7, e30563 (2012).
- Quintavalla, J., et al. Fluorescently labeled mesenchymal stem cells (MSCs) maintain multilineage potential and can be detected following implantation into articular cartilage defects. Biomaterials. 23, 109-119 (2002).
- Sasaki, M. Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. Journal of immunology. 180, 2581-2587 (2008).
- Spaeth, E. L. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS ONE. 4, e4992 (2009).
- Wels, J., Kaplan, R. N., Rafii, S., Lyden, D. Migratory neighbors and distant invaders: Tumor-associated niche cells. Genes and Development. 22, 559-574 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Tumor angiogenesis: molecular pathways and therapeutic targets. Nat. Med. 17, 1359-1370 (2011).
- Bataille, F. Multiparameter immunofluorescence on paraffin-embedded tissue sections. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 14, 225-228 (1097).
- van Vlierberghe, R. L., et al. Four-color staining combining fluorescence and brightfield microscopy for simultaneous immune cell phenotyping and localization in tumor tissue sections. Microscopy research and technique. 67, 15-21 (2005).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC cell biology. 9, 13 (2008).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Belizario, J. E., Akamini, P., Wolf, P., Strauss, B., Xavier-Neto, J. New routes for transgenesis of the mouse. Journal of applied. 53, 295-315 (2012).
