Komplekse vev massene, av organer til tumorer, er sammensatt av forskjellige cellulære elementer. Vi belyst bidrag av cellulære fenotyper i en vev utnytte multi-merket fluorescerende transgene mus i kombinasjon med multiparameter immunofluorescent flekker etterfulgt av spektral unmixing å dechiffrere celle opprinnelse samt celleegenskaper basert på protein uttrykk.
Med ønske om å forstå bidragene fra flere cellulære elementer til å utvikle et sammensatt vev, slik som de tallrike celletyper som deltar i regenererende vev, tumordannelse, eller vaskulogenese, har vi utviklet en flerfarget celletransplantasjonsmodell for tumorutvikling som cellepopulasjoner stammer fra forskjellige fluorescently fargede reporter gen mus og er transplantert, innpodet eller injiseres i og rundt et utviklings svulst. Disse fargede cellene blir deretter rekruttert og inkorporert inn i svulsten stroma. For å kvantitativt vurdere benmarg avledet stromale tumorceller, transplantert vi GFP uttrykker transgene hele benmarg inn lethally bestrålt RFP uttrykke mus som er godkjent av IACUC. 0ovarian svulster som ble orthotopically injisert i de transplanterte musene ble skåret i 6-8 uker etter engraftment og analysert for benmargs markør utstedt (GFP), så vel som antistoff-markører for å påvise tumor assosiertstroma bruker multispektrale bildeteknikker. Vi deretter tilpasset en metode vi kaller MIMicc-Multispectral Avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner, ved hjelp av multispektrale unmixing av fluoroprobes til kvantitativt vurdere hvilke merket celle kom fra hvilke start populasjoner (basert på originale reporter gen etiketter), og som vår evne til å unmix 4, 5 , 6 eller flere spektra per lysbilde øker, har vi lagt ekstra immunhistokjemi forbundet med celle linjene eller differensiering for å øke presisjonen. Utnytte programvare for å oppdage samlokalisert multipleksede-fluorescerende signaler, svulst stromal populasjoner kan spores, oppregnet og preget basert på markør farging. 1
Forstå vev utvikling og reparasjon er viktig å belyse deltar cellulære komponenter i sårheling, 2,3 regenerativ medisin, utviklingsbiologi og tumorbiologi. Under omstendighetene reparasjon, mange celletyper infiltrere omkringliggende mikromiljøet til hjelp i vascularization, ECM deponering, spredning og vev restrukturering. Cellulære faktorer og fenotyper kan identifiseres basert på multiparameter, multipleksede markører som kan identifisere lokalisering, differensiering status og samhandling mellom cellulære komponenter innenfor undersøkt mikromiljøet. Heri beskriver vi tumor utvikling som en prototypisk eksempel på dette flerfarget-flercellet transplantasjon modellen etterfulgt av multispektrale bildebehandling og spektral unmixing metodikk.
Tumorprogresjon er en flertrinns prosess som er preget av flere oppkjøpte funksjoner som omfatter økt spredning, enntiapoptotic, invasive og angiogenetiske egenskaper. 4 Tumor utvikling er tilrettelagt av ikke-neoplastiske celler som er rekruttert inn i det omkringliggende miljø for å gi vekstfaktorer, strukturelle matriser, vaskulære nettverk og immunmodulering. 1,5,6 Denne mikrohabitat består av celler som stammer fra lokale, nabo vev som adipose, og blodårer og fjerne kilder som for eksempel benmarg avledet celler en. Graden av ikke-neoplastisk celle inkorporering avhenger av etterspørselen fra tumoren, noe som ofte er den samme som fasen / karakteren av svulsten. For å forstå rollen av svulsten støttende mikromiljøet, må man forstå opprinnelsen og differensiering potensial av de ikke-neoplastiske cellepopulasjoner.
Denne protokoll er blitt utviklet for å hjelpe til med forståelsen av tumor progresjon gjennom visualisering av både benmarg avledet cellulære komponenter, og det lokale vevet derived celler. Utnytte fluorescerende reporter gen-uttrykke transgene mus, transplantert vi GFP (green-fluorescerende protein) benmarg til en lethally bestrålt RFP (red-fluorescerende protein) mus. Etter vellykket benmarg engraftment, er en syngene tumor cellelinje injisert orthotopically og lov til å innpode i 4-8 uker. Den resulterende tumor er fjernet fra musen og behandlet for immunofluorescent (IF) farging for å visualisere de stromale komponenter. Multipleksing IF markører er en vanlig brukt teknikk som innebærer betydelig optimalisering 7-9, men ved hjelp av en multispektrale avbildning / unmixing plattformen øker potensialet for fluoriserende fargestoff kombinasjoner som besitter spektral overlapping. Heri vi presentere en teknikk vi kaller MIMicc-multispektrale avhør av multiplekskanaler cellulære komposisjoner å farge og analysere opptil åtte markører innenfor en svulst seksjon på et enkelt lysbilde for å analysere de cellulære opprinnelse, cellulær differensiering stAtus og celle-celle interaksjoner av komponenter innenfor tumormikromiljøet. Dette forenklet eksempel har potensial til å bli utvidet på for å analysere fem, seks eller flere markører utnytte antistoffer eller intracellulær promoter-drevet fluorescerende uttrykk. Tabell 1 lister potensielle fluorescerende antistoffarging kombinert med egnede arter tatt i betraktning.
Heri beskriver vi anvendelse av multispektrale avbildning vi beskrive som MIMicc-multispektrale utspørring av Multiplexed cellulære sammensetninger, for å analysere de benmarg avledet stromale komponenter i tumor mikromiljøet, men denne metodikk og konsept kan benyttes til å tolke andre cellulære elementer som utgjør et komplekst vev som de sett under sårtilheling reaksjoner eller under en regenerativ vev. I disse forsøk benytter vi transgene mus for å fluorescensmerket skille de benmargceller avledet fra vert…
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige til diskusjoner, veiledning og støtte fra legene. Michael Andreeff MD, PhD., Og Jared Burks PhD. fra MD Anderson flowcytometri og Cellular Imaging Core Facility. Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083 639, R01NS06994, CA116199 og CA109451 for FCM. ELS er også støttet av hæren Department of Defense (BC083397).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
.2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|