Komplexa vävnadsmassor, från organ till tumörer, består av olika cellulära element. Vi klar bidrag cellulära fenotyper inom en vävnad som använder multi-märkta fluorescerande transgena möss i kombination med multi immunofluorescens färgning följt av spektral unmixing att dechiffrera cell ursprung samt cellernas egenskaper baserade på proteinuttryck.
Med en önskan att förstå bidragen från flera cellulära element för utvecklingen av en komplex vävnad, till exempel de många celltyper som deltar i regenerera vävnad, tumörbildning, eller vaskulogenes, vi utarbetat en flerfärgad celltransplantationsmodell för tumörutveckling i vilken cellpopulationer kommer från olika fluorescerande färgade reporter gen möss och transplanteras, engrafted eller injiceras i och kring en utveckling av tumör. Dessa färgade celler sedan rekryteras och införlivas i tumören stroma. För att kvantitativt bedöma benmärg härledda tumör stromaceller, transplanterade vi GFP uttrycka transgena hel benmärg in i dödligt bestrålade RFP uttrycka möss som godkänts av IACUC. 0ovarian tumörer som ortotopiskt injiceras i de transplanterade mössen exciderades 6-8 veckor efter inympning och analyserades för benmärgs markör av ursprung (GFP) samt markörer antikropp för att detektera tumörassocieratstroma med hjälp av multispektrala avbildningstekniker. Vi anpassade då en metod som vi kallar MIMicc-Multispectral Förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, med hjälp av multispektrala unmixing av fluoroprobes att kvantitativt bedöma vilka märkta cellen kom från vilken start populationer (baserat på ursprungliga reporter gen etiketter), och som vår förmåga att unmix 4, 5 , 6 eller fler spektra per slide ökar, har vi lagt till ytterligare immunhistokemi i samband med cellhärstamningar eller differentiering för att öka precisionen. Använda programvara för att upptäcka co-lokaliserade multiplexade-fluorescerande signaler, tumör stromal populationer kan spåras, räknas och karaktäriseras utifrån markör färgning. 1
Förstå vävnadsutveckling och reparation är viktigt att belysa deltar cellkomponenter i sårläkning, 2,3 regenerativ medicin, utvecklingsbiologi och tumörbiologi. Under omständigheterna reparation, många celltyper infiltrera omgivande mikromiljö till stöd i vaskularisering, ECM nedfall, spridning och omstrukturering vävnad. Cellulära faktorer och fenotyper kan identifieras utifrån multi, multiplexade markörer som kan identifiera lokaliseringen, differentieringsstatus och interaktion mellan cellkomponenter inom det undersökta mikromiljö. Häri beskriver vi tumörutveckling som en prototypiska exempel för denna multicolor-flercellig transplantationsmodell följt av multispektrala avbildning och spektral unmixing metodik.
Tumörprogression är en flerstegsprocess som präglas av flera förvärvade förmågor som inkluderar förbättrad spridning, enntiapoptotic, invasiva och angiogena egenskaper. fyra Tumör utveckling främjas av icke-neoplastiska celler som rekryteras till den omgivande miljön för att ge tillväxtfaktorer, strukturella matriser, vaskulära nätverk och immunmodulering. 1,5,6 Denna microhabitat består av celler som härrör från lokal, angränsande vävnader såsom fett, och blodkärl och avlägsna källor såsom benmärg härledda celler 1. Omfattningen av icke-neoplastisk cell inkorporering beror på efterfrågan från tumören, vilket ofta motsvarar scenen / grad av tumören. För att förstå betydelsen av tumören stödjande mikromiljö, måste man förstå ursprunget och differentieringspotentialen av de icke-neoplastiska cellpopulationer.
Detta protokoll har utformats för att hjälpa till vid tolkning av tumörprogression genom visualisering av både benmärg härledda cellkomponenter, och den lokala vävnads derived celler. Med hjälp av fluorescerande reporter gen-uttryckande transgena möss, transplanterade vi GFP (grönt fluorescerande protein) benmärg i ett dödligt bestrålat RFP (röd-fluorescerande protein) mus. Efter lyckad benmärgs engraftment, är en syngent tumörcellinjen injiceras orthotopically och får ympas i 4-8 veckor. Den resulterande tumören skärs ut från musen och bearbetades för immunofluorescens (IF)-färgning för att visualisera de stromala komponenter. Multiplexing IF markörer är en vanligt förekommande teknik som innebär betydande optimering 7-9, men med hjälp av en multispektrala avbildning / unmixing plattform förbättrar potentialen för fluorescerande markörkombinationer som besitter spektral överlappning. Häri presenterar vi en teknik som vi kallar MIMicc-multispektrala förhör av Multiplexade cellulära kompositioner för att färga och analysera upp till åtta markörer inom en tumör avsnitt om en enda bild för att analysera de cellulära ursprung, celldifferentiering stparater och cell-cell interaktioner av komponenter inom tumormicroenvironmenten. Denna förenklade exempel har potential att byggas ut på för att analysera fem, sex eller fler markörer som använder antikroppar eller intracellulär promotor-driven fluorescerande uttryck. Tabell 1 listar potentiella fluorescerande antikroppsfärgnings kombinationer med lämpliga arter beaktas.
Häri beskriver vi tillämpningen av multispektrala avbildning vi beskriver som MIMicc-multispektral förhör av Multiplexad cellulära kompositioner, för att analysera de benmärg härledda stromaceller komponenterna tumormicroenvironmenten emellertid denna metod och koncept kan appliceras på dechiffrera andra cellulära element som utgör en komplex vävnader, såsom de som ses under sårläkning reaktioner eller under en regenerativ vävnad. I dessa experiment använder vi transgena möss för att fluorescens särs…
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för diskussioner, vägledning och stöd från Dr. Michael Andreeff MD, PhD., Och Jared Burks PhD. från MD Anderson flödescytometri och Cell Imaging Core Facility. Detta arbete stöddes delvis av anslag från National Cancer Institute (RC1-CA146381, CA-083.639, R01NS06994, CA116199 och CA109451 till FCM. ELS stöds också av armén försvarsdepartementet (BC083397).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |||||||||||||||||||||||||||||
.2 μm filter | Fisher | 09-740-35A | |||||||||||||||||||||||||||||
10 ml lure lock | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||
25 G needle | Cardinal | BF305122 | |||||||||||||||||||||||||||||
40nm filter | BD | 352340 | |||||||||||||||||||||||||||||
50 ml conical tube | Fisher | 1495949A | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 488-ms1 | invitrogen | A21121 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 594-Rb | invitrogen | A21207 | |||||||||||||||||||||||||||||
Alexafluor 647-ch | Invitrogen | A21449 | |||||||||||||||||||||||||||||
BSA | Sigma | A7906-500G | |||||||||||||||||||||||||||||
Cover slips | Corning | 2940-243 | |||||||||||||||||||||||||||||
CRI-Nuance | Caliper Life Sciences | ||||||||||||||||||||||||||||||
Dapi | Invitrogen | D1306 | |||||||||||||||||||||||||||||
DMEM | CellGro | 10-017-CV | |||||||||||||||||||||||||||||
Ethanol | Dharmacon | 4004-DV | |||||||||||||||||||||||||||||
FBS | invitrogen | 16000-044 | |||||||||||||||||||||||||||||
GFP-ms1 | Abcam | ab38689 | |||||||||||||||||||||||||||||
Insulin needle | BD | 329424 | |||||||||||||||||||||||||||||
Maleic acid | Acros | 100-16-7 | |||||||||||||||||||||||||||||
Moisture chamber box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |||||||||||||||||||||||||||||
Mounting media | dako | S3023 | |||||||||||||||||||||||||||||
Nail hardener | Sally Hansen | 2103 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pap pen | Abcam | Ab2601 | |||||||||||||||||||||||||||||
Pen/Strep L Glut | invitrogen | 10378016 | |||||||||||||||||||||||||||||
Steril PBS | invitrogen | 14040-182 | |||||||||||||||||||||||||||||
Trypsin | invitrogen | 252000-56 | |||||||||||||||||||||||||||||
Blocking Buffer
Antigen retrieval buffers:
|