الحصول على الإسفار الوقت الفاصل بين الأفلام من الخميرة في مهدها وتحليل ديناميات وحيدة الخلية باستخدام الطعوم
Summary
نقدم بروتوكول بسيط للحصول على الأفلام المجهري مضان من خلايا الخميرة في التزايد، ومجموعة من البرامج المستندة إلى واجهة المستخدم الرسومية لاستخراج البيانات وحيدة الخلية سلسلة زمنية. يتضمن تحليل النسب الآلي وتقسيم الوقت الاحالة متكاملة مع الفحص البصري وكرأيشن اليدوي للبيانات مجنزرة.
Abstract
أصبحت مضان الوقت الفاصل بين المجهري أداة قوية في دراسة العديد من العمليات البيولوجية على مستوى خلية واحدة. على وجه الخصوص، والأفلام التي تصور الاعتماد الزمانية في التعبير الجيني توفير نظرة ثاقبة على ديناميات تنظيمه، ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية إلى الحصول على وتحليل الأفلام مضان من الخلايا واحد. نحن هنا وصف بروتوكول بسيطة باستخدام المتاحة تجاريا جهاز الثقافة ميكروفلويديك لتوليد مثل هذه البيانات، و، واجهة المستندة إلى MATLAB المستخدم الرسومية (GUI) المستندة إلى حزمة برامج لقياس الصور مضان. قطاعات البرمجيات وخلايا المسارات، وتمكن المستخدم من الإشراف أخطاء في البيانات بصريا، وتلقائيا بتعيين النسب والأوقات الانقسام. يحلل GUI مزيد من السلسلة الزمنية لإنتاج آثار خلية كاملة وكذلك مشتقاتها المرة الأولى والثانية. في حين تم تصميم البرنامج لS. الخباز، ينبغي نمطية وبراعة تسمح لها رس تكون بمثابة منصة لدراسة أنواع الخلايا الأخرى مع بعض التعديلات.
Introduction
وقد عززت تحليل وحيدة الخلية في التعبير الجيني فهمنا لكثير من جوانب تنظيم الجينات. لقطات ثابتة من الفلورسنت التعبير مراسل باستخدام التدفق الخلوي أو المجهري تقديم معلومات مفيدة عن توزيع للتعبير عن خلية واحدة، ولكنها تفتقر إلى تاريخ وتطور بيانات السلاسل الزمنية اللازمة لإبلاغ مباشرة ديناميات التعبير الجيني. يعرض مضان المجهري الوقت الفاصل بين وسيلة للحصول على كل القياسات وحيدة الخلية وتاريخهم. وقد تم تطوير تقنيات التجريبية والتحليلية المختلفة للحصول على وكميا أفلام من الفلورسنت التعبير الصحفي، وبالتالي إضفاء نظرة ثاقبة ميزات تنظيم الجينات (انظر 1 للمراجعة) مثل الاختلاف الخلية الى خلية 2،3، تشكيل persister البكتيرية 4، النسخ بدء واستطالة 5، النسخي انفجار 6،7، والاعتماد دورة الخلية 8،9، والتوريث 10. ومع ذلك، OBTينطوي aining سلسلة زمنية مضان وحيدة الخلية جودة تحديات تقنية كبيرة في زراعة أحادي الطبقة من الخلايا في بيئة يمكن السيطرة عليها والكمي في الإنتاجية العالية من الأفلام مضان المكتسبة. هنا، نحن تصف الإجراء إلى الحصول على وتحليل الأفلام مضان من S. الخباز مع عدم وجود الخبرة المطلوبة في خلية تصنيع جهاز الثقافة أو في مجال تطوير البرمجيات (الشكل 1).
أولا، نحن بالتفصيل بروتوكول سبيل المثال لتوليد مضان سلسلة أفلام وقت لالخميرة في مهدها التعبير عن واحد أو أكثر للصحفيين الفلورسنت. على الرغم من الغرف ثقافة ميكروفلويديك مخصصة تم بناؤها واستخدامها بنجاح 11-13 سابقا، ونحن نستخدم جهاز ميكروفلويديك المتاحة تجاريا من CellAsic (هايوارد، كاليفورنيا). حدود خلايا الجهاز إلى نمو أحادي الطبقة ويسمح التحكم المستمر للبيئة نضح. بروتوكول المجهري نقدم وسيلة بسيطة للحصول على fluorescقد تكون بديلا الأفلام جزأين من الخميرة في مهدها، ولكن أي تعديل بروتوكول التجريبية (جهاز الثقافة حسب الطلب، وظروف وسائل الإعلام البديلة، الخ.) مما أسفر عن بيانات الفيلم مضان مماثلة لخلايا الخميرة واحد.
المقبل، ونحن الخطوط العريضة لتحليل الأفلام باستخدام واجهة المستخدم الرسومية (GUI) المستندة إلى حزمة البرامج في MATLAB (ماثووركس، ناتيك، MA)، ويطلق عليها اسم واجهة المستخدم الرسومية لتحليل سريع من الإسفار السلاسل الزمنية (قلم الكتاب)، لاستخراج بيانات السلاسل الزمنية للخلايا واحدة. قلم الكتاب له سمات مشابهة لتنوعا، وحزمة برمجيات المصدر المفتوح 14 خلية-ID في بتجزئة وتتبع الخلايا واستخراج في كثافة مضان والمعلومات الهندسية. ومع ذلك، قلم الكتاب يوفر ميزات إضافية هامة. أولا، فإنه يوفر سهولة التحرير التفاعلية من تجزئة والنتائج تتبع للتحقق من دقة البيانات، بدلا من مجرد النابضة الإحصائية من آثار المنطقة ناشز بعد التحليل. وعلاوة على ذلك، فإنه يمتد إلى تحليل تلقائيا.Y المكلف النسب ونقاط دورة الخلية من الفائدة من الخميرة في مهدها. تحديد متى الأم وابنتها تقسيم لتشكيل منطقتين خلية مستقلة أمر حاسم لتحديد الخلية بأكملها (بما في ذلك أي الأم برعم متصل) القياسات طوال دورة الخلية 8. يتكون الجناح من ثلاث وحدات لإنجاز هذه المهام. شرائح أول المناطق الخلايا استنادا إلى التناقض بين الصور مجال مشرق مركزة وغير مركزة، ويسمح للمستخدم لتحديد واختبار بصريا المعلمات تجزئة. المسارين الثاني (. باستخدام بلير وتنفيذ MATLAB Dufresne لمن كروكر وآخرون IDL الروتينية، متاحة في: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) ويقيس مناطق الخلية عبر الزمن؛ تلقائيا بتعيين الأنساب، وتمكن الفحص البصري وتصحيح الخطأ. يتم تضمين واجهة المستخدم الرسومية بسيطة بالتآمر لاستعلام خصائص خلية واحدة. وحدة ثالث ينسب ظهور برعم والانقسام TIMES، وإخراج كاملة بيانات السلاسل الزمنية المحمولة، فضلا عن مشتقاتها المرة الأولى والثانية (كما تمت مناقشته في 9). وحدة تحليل إخراج البيانات كملف نصي الفضاء بفواصل لدراسة لاحقة في البرنامج الإحصائي للاختيار. وهكذا، فإن حزمة تمكن المستخدم لاستخراج بيانات السلاسل الزمنية ذات جودة عالية من خلال واجهة رسومية. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لتقدير معدلات النسخ في الوقت الحقيقي في خلايا الخميرة في مهدها واحدة بوصفها وظيفة من دورة الخلية 9. بينما تم تحسين وحدات للخميرة في مهدها، المعلمات أو، إذا لزم الأمر، يمكن تكييفها رمز متاحة بحرية للكائنات الحية الأخرى وأنواع الصور. قد يكون الإنقسام، وتتبع، ونسب خوارزميات مهمة محددة لأنواع التصوير وتعيين الكائن في السؤال. ويمكن الاستعاضة عن خوارزميات القائمة، ولكن ما زالت تحتفظ واجهة المستخدم الرسومية التي تتيح التفتيش سهلة الاستخدام البصرية وتصحيح الأخطاء تجزئة وتتبع دائما أن occuR مع أي خوارزمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف البروتوكول أعلاه طريقة بسيطة للحصول على وتحليل مضان بيانات السلاسل الزمنية مع خبرة محدودة في على microfluidics أو في مجال تطوير البرمجيات. فإنه يسمح احد للحصول على الوقت الفاصل بين الأفلام مضان من خلايا الخميرة واحد؛ استخراج حجم الخلية ذات الصلة والقياسات التعبير؛ تت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إميلي جاكسون، جوشوا Zeidman، ونيكولاس رين للتعليقات على البرنامج. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل GM95733 (إلى NM)، ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا BBBE 103316 أموال بدء التشغيل (لNM).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
