Aquisição de fluorescência Filmes Time-lapse da levedura de brotamento e análise da dinâmica de células simples utilização de enxertos
Summary
Nós apresentamos um protocolo simples de se obter filmes de microscopia de fluorescência de crescimento de células de levedura, e um pacote de software baseado em GUI para extrair dados de séries temporais de uma única célula. A análise inclui linhagem automatizada e divisão atribuição tempo integrado com inspeção visual e curadoria manual de dados controladas.
Abstract
Microscopia de lapso de tempo de fluorescência tornou-se uma ferramenta poderosa no estudo de muitos processos biológicos ao nível de uma única célula. Em particular, os filmes que descrevem a dependência temporal da expressão gênica fornecer insights sobre a dinâmica de sua regulamentação, no entanto, existem muitos desafios técnicos para a obtenção e análise de filmes de fluorescência de células individuais. Descrevemos aqui um protocolo simples, usando um dispositivo de cultura microfluídicos disponível comercialmente para gerar esses dados e uma interface baseada em MATLAB gráfica do usuário (GUI) baseada em software para quantificar as imagens de fluorescência. Os segmentos de software e células pistas, permite ao usuário curadoria visualmente erros nos dados e automaticamente atribui linhagem e os tempos de divisão. A GUI analisa a série mais tempo para produzir vestígios de células inteiras, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo. Enquanto o software foi concebido para S. cerevisiae, a sua modularidade e versatilidade deve permitir que ele tó servir como uma plataforma para o estudo de outros tipos de células, com poucas modificações.
Introduction
Análise de uma única célula da expressão gênica tem promovido a nossa compreensão de muitos aspectos da regulação gênica. Instantâneos estáticos de expressão repórter fluorescente utilizando citometria de fluxo ou microscopia de fornecer informações úteis sobre a distribuição de expressão de uma única célula, mas falta a história ea evolução dos dados de séries temporais obrigados a informar diretamente a dinâmica de expressão gênica. Microscopia de lapso de tempo de fluorescência apresenta um meio para obter ambas as medições de uma única célula e sua história. As várias técnicas experimentais e analíticas foram desenvolvidos para a obtenção de filmes e quantificar a expressão de repórter fluorescente, comunicando assim insights características de regulação de genes (ver 1 para uma revisão), tais como variação de célula para célula de 2,3, a formação bacteriana persistidor 4, transcrição iniciação e alongamento 5, transcricional estourando 6,7, a dependência do ciclo celular 8,9 e herdabilidade 10. Contudo, obtaining qualidade séries cronológicas de fluorescência de uma única célula envolve desafios técnicos significativos, em cultura de uma monocamada de células em um ambiente controlado e quantificação de elevada capacidade de os filmes de fluorescência adquiridos. Aqui, descrevemos um procedimento para obter e analisar filmes de fluorescência de S. cerevisiae sem experiência requerida na fabricação do dispositivo de cultura de células ou no desenvolvimento de software (Figura 1).
Primeiro, vamos detalhar um protocolo de exemplo para gerar filmes de séries temporais de fluorescência para a levedura de brotamento expressar um ou mais repórteres fluorescentes. Embora câmaras cultura microfluídicos personalizados foram construídas e empregada com sucesso anteriormente 11-13, usamos um dispositivo micro disponível comercialmente a partir de CellAsic (Hayward, CA). As células do sistema limita-se a crescimento em monocamada e permite o controle permanente do meio ambiente de perfusão. O protocolo de microscopia que apresentamos é uma forma simples de se obter fluoresfilmes cia de levedura de brotamento, mas qualquer protocolo modificado experimental (um dispositivo de cultura personalizada, condições de mídias alternativas, etc.) produzindo dados do filme de fluorescência semelhantes de células de levedura único pode ser substituído.
A seguir, destacamos a análise dos filmes com uma interface gráfica de usuário (GUI) baseada em software em MATLAB (Mathworks, Natick, MA), apelidado de GUI para rápida análise de séries temporais de fluorescência (ENXERTOS), para extrair dados de séries temporais para células individuais. ENXERTOS tem características semelhantes ao versátil, open-source software pacote Cell-ID 14 na segmentação e rastreamento de células e na extração de intensidade de fluorescência e de informação geométrica. No entanto, os enxertos fornece recursos adicionais importantes. Primeiro, ela oferece edição interativa fácil de segmentação e acompanhamento dos resultados a fim de verificar a exatidão dos dados, ao invés de apenas gating estatística de traços região outlier após análise. Além disso, estende-se a análise para automatically designado linhagem e pontos de interesse da levedura de brotamento do ciclo celular. Determinar quando mãe e filha dividem para formar duas regiões de células independentes é crucial para determinar células inteiras (mãe incluindo qualquer broto conectado) medições ao longo do ciclo celular 8. A suite é composta por três módulos para realizar essas tarefas. As primeiras regiões celulares segmentos baseados no contraste entre as imagens de campo claro foco e fora de foco, e permite ao usuário definir e testar visualmente parâmetros de segmentação. O segundo faixas (. Usando Blair e implementação de Dufresne MATLAB do Crocker et al rotina IDL, disponível em: http://physics.georgetown.edu/MATLAB/ ) e medidas de regiões celulares através do tempo; atribui automaticamente linhagens, e permite a inspeção visual e correção de erros. A GUI plotagem simples é incluído para propriedades de uma única célula de consulta. O terceiro módulo atribui bud surgimento e divisão times, células inteiras e gera dados de séries de tempo, bem como as suas primeira e segunda derivadas de tempo (como discutido em 9). O módulo de análise gera os dados como um arquivo de texto delimitado por espaço para o estudo subsequente no software estatístico de escolha. Assim, o pacote permite ao usuário extrair dados de alta qualidade da série de tempo através de uma interface gráfica. Nós temos utilizado este método para estimar as taxas de transcrição em tempo real em células individuais de levedura de brotamento como uma função do ciclo da célula 9. Embora os módulos foram optimizados para a levedura de brotamento, os parâmetros, ou, se necessário, o código livremente disponíveis podem ser adaptados para outros organismos e tipos de imagem. Segmentação, Seguimento e linhagem algoritmos de atribuição pode ser específica para tipos de imagem atribuída eo organismo em questão. Os algoritmos existentes poderia ser substituído, mas ainda mantêm a interface gráfica que permite inspeção user-friendly visual e correção de erros de segmentação e rastreamento que invariavelmente ocur com qualquer algoritmo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descreve um método simples de se obter e analisar fluorescência dados de séries temporais com experiência limitada em microfluídica ou no desenvolvimento de software. Ele permite a obtenção de time-lapse filmes de fluorescência das células de levedura de solteiro; extrair o tamanho da célula relevante e medições de expressão; rastreamento cura e atribuições da linhagem, e analisar o comportamento de células inteiras ao longo do tempo usando um dispositivo cultura microfluídicos comerci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Emily Jackson, Joshua Zeidman, e Nicholas Wren para comentários sobre o software. Este trabalho foi financiado pelo GM95733 (para NM), BBBE 103.316 e MIT fundos de inicialização (para NM).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Y04C Yeast Perfusion Plate | CellAsic | Y04C-02 | |
| ONIX Microfluidic Perfusion Platform | CellAsic | EV-262 | |
| Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | ||
| Plan-Apochromat 63X/1.40 Oil DIC objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| Cascade II EMCCD camera | Photometrics | ||
| Lumen 200 metal-halide arc lamp | PRIOR Scientific | ||
| Triple-bandpass dichroic filter cube and excitation and emission filter set | Chroma Technology Corp | set #89006 | Used for YFP (Venus/Citrine), CFP (Cerulean), RFP (mCherry/tdTomato) |
| MAC 5000 controller and filter wheels | Ludl Electronic Products | ||
| MATLAB R2011a | Mathworks | 64-bit version handles large data files better than 32-bit |
References
- Locke, J. C. W., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews. Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
- Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene Regulation at the Single-Cell Level. Science. 307 (5717), 1962-1965 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Khalil, A. S., Collins, J. J. Signaling-mediated bacterial persister formation. Nature Chemical Biology. 8 (5), 431-433 (2012).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-Time Observation of Transcription Initiation and Elongation on an Endogenous Yeast Gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S., Cox, E. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1061 (2005).
- Suter, D. M., Molina, N., Gatfield, D., Schneider, K., Schibler, U., Naef, F. Mammalian Genes Are Transcribed with Widely Different Bursting Kinetics. Science. 332 (6028), 472-474 (2011).
- Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2676-2681 (2010).
- Zopf, C. J., Quinn, K., Zeidman, J., Maheshri, N. Cell-cycle dependence of transcription dominates noise in gene expression. , (2013).
- Kaufmann, B. B., Yang, Q., Mettetal, J. T., Van Oudenaarden, A. Heritable stochastic switching revealed by single-cell genealogy. PLoS Biology. 5 (9), e239 (2007).
- Cookson, S., Ostroff, N., Pang, W. L., Volfson, D., Hasty, J. Monitoring dynamics of single-cell gene expression over multiple cell cycles. Molecular Systems Biology. 1 (1), 2005.0024 (2005).
- Paliwal, S., Iglesias, P. A., Campbell, K., Hilioti, Z., Groisman, A., Levchenko, A. MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast. Nature. 446 (7131), 46-51 (2007).
- Charvin, G., Cross, F. R., Siggia, E. D. A microfluidic device for temporally controlled gene expression and long-term fluorescent imaging in unperturbed dividing yeast cells. PloS One. 3 (1), e1468 (2008).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Meth. 4 (2), 175-181 (2007).
- Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Trans. Sys. Man. Cyber. 9 (1), 62-66 (1979).
- Goranov, A. I., Cook, M., et al. The rate of cell growth is governed by cell cycle stage. Genes & Development. 23 (12), 1408-1422 (2009).
- To, T. -. L., Maheshri, N. Noise Can Induce Bimodality in Positive Transcriptional Feedback Loops Without Bistability. Science. 327 (5969), 1142-1145 (2010).
- O’Neill, E. M., Kaffman, A., Jolly, E. R., O’Shea, E. K. Regulation of PHO4 nuclear localization by the PHO80-PHO85 cyclin-CDK complex. Science. 271 (5246), 209-212 (1996).
- Raser, J. M., O’Shea, E. K. Control of stochasticity in eukaryotic gene expression. Science. 304 (5678), 1811-1814 (2004).
